腐殖酸和半胱氨酸對Shewanella oneidensis MR-1生物轉化硫化汞的影響

陳 艷,黃 瀟,司友斌(安徽農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院,安徽 合肥 230036)

腐殖酸和半胱氨酸對Shewanella oneidensis MR-1生物轉化硫化汞的影響

陳 艷,黃 瀟,司友斌*(安徽農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院,安徽 合肥 230036)

研究了不同濃度腐殖酸和半胱氨酸條件下,鐵還原菌Shewanella oneidensis MR-1對固態(tài)硫化汞的生物溶解和甲基化作用.結果表明,固態(tài)硫化汞的生物溶解量隨加入腐殖酸濃度的增大而增加,當腐殖酸濃度為10mg/L時,固態(tài)硫化汞的溶解量約為3.35mg/L;在腐殖酸濃度為1～5mg/L范圍內, S. oneidensis MR-1對硫化汞的生物甲基化率呈上升趨勢,在5～10mg/L范圍時呈下降趨勢,其中生物甲基化率最大值約為10.55%;加入不同濃度半胱氨酸對菌株生物溶解固態(tài)硫化汞的影響不明顯,但能增加S. oneidensis MR-1對硫化汞的生物甲基汞生成量,加速甲基化反應進程,使硫化汞的生物甲基化率提高至19.23%.該研究為自然水體生態(tài)系統(tǒng)中鐵還原菌參與固態(tài)硫化汞生物溶解及生物甲基化提供了直接證據(jù).

鐵還原菌；硫化汞；生物轉化；腐殖酸；半胱氨酸

汞是一種有毒的重金屬物質,其有機化合物甲基汞能在生物體內,尤其是魚體內[1]進行生物累積和生物放大,具有致神經(jīng)毒性.甲基汞的產(chǎn)生主要發(fā)生在厭氧的沉積物和土壤中,經(jīng)過微生物如某些硫酸鹽還原菌[2]和鐵還原菌[3]作用,將無機汞轉化為甲基汞.Fleming等[4]報道分離出的鐵還原菌菌株Geobacter sp. CLFeRB在純培養(yǎng)時的汞甲基化率與硫酸鹽還原菌相當.由此,鐵還原菌(FeRB)對汞甲基化的研究成為近年來研究的熱點.奧奈達希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)為革蘭氏染色陰性兼性厭氧細菌,是最先被闡明通過 Fe(Ⅲ)還原使有機物氧化獲得生長能量的細菌,根據(jù)細菌16S rRNA基因的系統(tǒng)分析法, S. oneidensis MR-1已被認定為γ-變形菌門的亞群[5],屬于鐵還原細菌.

在自然界的沉積物和水環(huán)境中,有機質的濃度遠高于汞污染物的濃度[6],二價汞離子能夠與有機質形成結合能力很強的絡合物,因為二價汞離子和有機質中的硫基、巰基官能團相結合[7],形成的絡合物限制了微生物對汞離子的生物轉化[8].但也有研究指出,二價汞離子與小分子量硫醇相結合時,如半胱氨酸,能夠促進微生物對汞的甲基化[9].另外,硫化物與 Hg(Ⅱ)也有很強的結合能力,決定著汞化合物在厭氧環(huán)境下的各種形態(tài).已有很多學者探索了 Hg(Ⅱ)、硫化物、有機質之間的相互作用,特別是 Hg(Ⅱ)在水環(huán)境中的遷移轉化[10].

單質汞(Hg)存在于自然界中比較少,主要是以固態(tài)硫化汞(HgS)的形態(tài)存在,這種化合物亦稱為汞砂,廣泛存在于土壤和自然沉積物中,通常認為很難被微生物轉化.但有相關研究指出,納米顆粒HgS能夠存在于水體表層及污染的沉積物中[11],且能夠被甲基化微生物高效轉化[12].已有很多研究探討了 Hg2+和有機物質之間的相互作用,但鐵還原菌S. oneidensis MR-1對固態(tài)硫化汞轉化的研究卻相對較少.本研究通過對鐵還原菌S. oneidensis MR-1進行純培養(yǎng),在實驗室模擬條件下,探討S. oneidensis MR-1在不同濃度腐殖酸、半胱氨酸存在時,對固態(tài)硫化汞的生物溶解及生物甲基化作用的影響,以期為沉積物中汞污染防治提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

硫化汞(HgS)、甲基汞(MeHg),純度 95%以上,均購于Merck公司.MeHg為溶于甲醇的1000mg/L貯備液,置于 4℃冰箱中用棕色瓶保存,所需稀溶液用超純水依次逐級稀釋.原子熒光的載流硝酸(HNO3)和還原劑硼氫化鉀(KBH4)以及氫氧化鉀(KOH)為優(yōu)級純,水為Mili-Q超純水,其他試劑均為分析純.

菌種來源:S. oneidensis MR-1由西北農(nóng)林科技大學土壤微生物實驗室提供.

S. oneidensis MR-1培養(yǎng)基(g/L):KH2PO4?7H2O 3.0, Na2HPO4?7H2O 12.8, NH4Cl 1.0, NaAc 2.0, 酵母抽提物2.0.

LB富集培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0, NaCl 5.0, pH=7.0;固體培養(yǎng)基再按1.5%～2%的比例加入瓊脂粉,121℃滅菌30min.

1.2 實驗方法

菌株的厭氧培養(yǎng):在超凈厭氧工作臺上,高純N2通過一個裝有細菌過濾器的塑膠管充入裝有培養(yǎng)液的棕色瓶中,充氣15min后,快速擰緊瓶蓋密封后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng).

將1mL S. oneidensis MR-1菌懸液無菌操作接種至含有1mg HgS的液體培養(yǎng)基的棕色瓶中,使總體積約為20mL,形成HgS懸浮液,設計觀察不同濃度腐殖酸和半胱氨酸對硫化汞生物溶解和生物甲基化的影響,厭氧處理后,恒溫避光靜置培養(yǎng).培養(yǎng)時間為14d,分別于0,0.5,1,2,3,4,5,6,7,9, 11,13,14d取樣,測定溶解態(tài)汞濃度及甲基汞含量.實驗同時以不加S. oneidensis MR-1菌懸液作為對照.每處理3次重復.

1.3 樣品處理與汞的測定

樣品經(jīng)過 4000r/min離心分離后,測定上清液中無機汞、甲基汞和總汞的含量.

1.3.1 無機汞和甲基汞的測定 上清液樣品經(jīng)25% KOH/甲醇溶液提取后,用0.22 μm濾膜過濾,再加入0.05mol/L TBABr(四丁基溴化銨)溶液混合衍生成絡合物,然后進樣測定[13].測定采用Agilent 1100 高效液相色譜儀,配可變波長紫外檢測器和 HP化學工作站.色譜操作條件[14]: C18Hypersil ODS色譜柱(4.6mm×150mm, 5μm),流動相為含 0.01mol/L TBABr和 0.025mol/L NaCl的水溶液:甲醇=45:55(體積比),柱溫 35℃,流速 1.0mL/min,檢測波長為 225nm,進樣量為20μL.

1.3.2 溶液中總汞的測定 采用 AFS-230E型雙道氫化物發(fā)生原子熒光(北京科創(chuàng)海光儀器有限公司)測定總汞.樣品經(jīng)4000r/min離心15min,用0.22 μm濾膜過濾后,進行消解[15]:加入1.5mL硫酸, 1.5mL (1+1)硝酸, 4mL 5%高錳酸鉀, 4mL 5%過硫酸鉀,補充適量去離子水約至50mL,置沸水浴中 1h.臨近測定時,邊搖邊滴加 20%鹽酸羥胺溶液直到剛好使過剩高錳酸鉀褪色及二氧化錳全部溶解為止,最后測定.

雙道氫化物發(fā)生原子熒光操作條件[15]:空心陽極汞電流強度為24mA,儀器的負高壓為280V,載氣流氬氣流速為400mL/min,載流中硝酸濃度為2%,氫氧化鉀的濃度為10g/L,硼氫化鉀濃度為5g/L.

2 結果與討論

2.1 S. oneidensis MR-1對HgS的生物轉化動力學

在S. oneidensis MR-1作用下,當腐殖酸濃度為5mg/L,初始pH值為7.0時,上清液中離子汞、甲基汞和溶解態(tài)總汞的濃度隨時間的變化趨勢如圖1所示.其中上清液中測得的溶解態(tài)總汞濃度約等于離子汞和甲基汞濃度之和.在不加 S. oneidensis MR-1,其他條件相同時,上清液中檢測到的溶解態(tài)汞最大值不超過20μg/L(實驗數(shù)據(jù)未列出),而加菌處理后檢測到的上清液溶解態(tài)汞是未加菌處理的 90倍之多.因此, S. oneidensis MR-1的存在明顯促進了固態(tài)硫化汞在含腐殖酸溶液中的溶解.基汞含量約是未添加半胱氨酸處理的1.85倍,如圖2所示.由圖2可見,半胱氨酸的加入明顯縮短了菌株對硫化汞生物轉化的反應時間,其中溶解態(tài)總汞、無機汞和甲基汞濃度都在第2d達到最大值,且第 4d即達到反應平衡,其中菌株對固態(tài)硫化汞的甲基化率提高到19.16%.

圖2 半胱氨酸存在時S. oneidensis MR-1對HgS生物轉化動力學Fig.2 Dynamics of HgS biotransformation by S. oneidensis MR-1in the presence of cysteine

圖1 腐殖酸存在時S. oneidensis MR-1對HgS生物轉化動力學Fig.1 Dynamics of HgS biotransformation by S. oneidensis MR-1in the presence of humic acid

由圖 1可見,溶解態(tài)總汞和離子汞濃度在第3d達到最大值,甲基汞濃度在第2d達到最大值,之后都有略微下降,可能是汞揮發(fā)所致,至反應第9d達到穩(wěn)定狀態(tài),其中汞甲基化率最大值約為10.55%.另外,當其他條件相同,溶液中添加300mg/L半胱氨酸時,上清液中溶解態(tài)總汞濃度變化較小,但能夠促進菌株對硫化汞的甲基化,甲

2.2 S. oneidensis MR-1對HgS的生物溶解作用

2.2.1 腐殖酸(HA)對S. oneidensis MR-1生物溶解HgS的影響 在溫度為30℃, pH 7.0,腐殖酸濃度分別為 1.0,3.0,5.0,10.0mg/L時,上清液中總汞濃度隨時間的變化趨勢如圖 3所示. S. oneidensis MR-1對硫化汞的溶解量隨著腐殖酸濃度的增大而增加,并在第 3d達到最大值,之后有略微下降,至第7d上清液中汞濃度不再變化達到平衡.其中有略微下降的原因可能是因為溶解態(tài)汞揮發(fā)所致,當腐殖酸濃度為 10mg/L時,上清液中檢測到的最大溶解態(tài)汞濃度為3.15mg/L,是未添加腐殖酸時的114倍之多.這是因為HgS能夠和 HA 中的硫醇官能團相結合,形成HgS-HA絡合物,加強了溶液中固態(tài)硫化汞的溶解性. Haitzer等[16]認為腐殖質的芳香性和分子量大小影響著HgS和腐殖質之間的相互作用.相關研究

圖3 腐殖酸(HA)對S. oneidensis MR-1生物溶解HgS的影響Fig.3 Effect of humic acid on HgS biological dissolution by S. oneidensis MR-1

[17-18]表明,腐殖質能夠減緩HgS的聚合和結晶度,因此腐殖質能夠通過減緩HgS的聚合、結晶速度來加強微生物對 HgS的生物轉化.另外,HgS與腐殖質絡合物結合強度與腐殖質本身顆粒物的大小密切相關,從而影響到HgS的溶解性[10]以及自然環(huán)境中甲基汞的生成量[19].不能明顯地促進固態(tài)硫化汞的溶解.半胱氨酸是一種小分子量的氨基酸,含有還原性巰基,HgS可以和半胱氨酸的巰基結合形成HgS-Cys絡合物,這一絡合物的分子量較小,與HgS-HA相比較更有利于鐵還原菌S. oneidensis MR-1對其的生物轉化.此外,也有文獻指出,半胱氨酸能夠加強甲基化微生物對二價汞離子的生物轉化,促進無機汞轉化為甲基汞[9,20].

圖4 半胱氨酸(Cys)對S. oneidensis MR-1生物溶解HgS的影響Fig.4 Effect of cysteine on HgS biological dissolution by S. oneidensis MR-1

2.2.2 半胱氨酸(Cys)對S. oneidensis MR-1生物溶解HgS的影響 在S. oneidensis MR-1作用下,當溫度為30℃, pH 7.0,腐殖酸濃度為5mg/L,半胱氨酸濃度分別為 100,200,300,400mg/L時,上清液中溶解態(tài)汞濃度隨時間的變化趨勢如圖4所示.上清液中溶解態(tài)汞濃度隨半胱氨酸濃度的增加呈上升趨勢,但上升幅度略小,而這略微上升的趨勢主要是因為半胱氨酸的存在增強了 S. oneidensis MR-1對HgS的生物轉化,增加了HgS的電離程度,并在第3d達到最大值,之后有略微下降,可能是溶解態(tài)汞絡合物揮發(fā)所致,至第9d時達到平衡.當不添加腐殖酸,僅有不同濃度的半胱氨酸存在時,上清液中檢測到的溶解態(tài)汞濃度很小,不超過20μg/L(數(shù)據(jù)未列出),因此得出半胱氨酸的存在并

2.3 S. oneidensis MR-1對HgS的生物甲基化作用

2.3.1 腐殖酸(HA)對S. oneidensis MR-1生物甲基化HgS的影響 當溫度為30℃, pH 7.0,腐殖酸濃度分別為1.0,2.0,3.0,5.0,10.0mg/L時,上清液中甲基汞濃度隨時間的變化趨勢如圖 5所示.在上清液中溶解態(tài)汞產(chǎn)生的同時,也檢測出甲基汞的存在,并且甲基汞含量在第2d即達到最大值,之后含量隨時間而逐步下降,至第9d達到平衡.

當腐殖酸濃度為 5mg/L 時, S. oneidensis MR-1對硫化汞的甲基化生成量最大,為284.5μg/L.腐殖酸濃度在 1.0～5.0mg/L時,上清液甲基汞呈上升的趨勢;腐殖酸濃度在5.0～10.0mg/L時,上清液中甲基汞增加不多,上清液中甲基汞的含量并非隨著腐殖酸濃度的增加而呈上升趨勢.這是因為當腐殖酸濃度在 1.0～5.0mg/L時,上清液中第2～3d溶解態(tài)汞濃度為1.18～2.64mg/L, S. oneidensis MR-1在這個范圍內活性較高,甲基化效率較好,達到10.55%;當腐殖酸濃度為5.0～10.0mg/L時,上清液中第 2～3d溶解態(tài)汞濃度為 2.33～3.35mg/L, S. oneidensis MR-1在這個汞濃度范圍內其活性受到一定程度的抑制,甲基化效率降低.有很多研究發(fā)現(xiàn),沉積物、水體和生物體中的甲基汞含量會隨著可溶性有機質含量的升高而增加[21],尤其是芳香族有機物有利于汞的釋放,能促進汞的甲基化.在湖泊沉積物中, MeHg含量與有機質變化趨勢相近,MeHg含量的垂直分布均在表層富集,且隨深度增加逐漸降低趨于穩(wěn)定,且兩者存在極顯著性相關,說明有機質對湖泊沉積物MeHg的分布起到重要作用[22]. 2d達到最高值,第4d時達到反應平衡,未加入半胱氨酸處理,甲基汞的轉化率約為10%,當半胱氨酸濃度為400mg/L時,第2d時上清液中甲基汞含量最高,為549.2μg/L,轉化率達到19.23%.其中半胱氨酸含量從100mg/L增加到300mg/L時,甲基汞轉化率明顯提高,達到300mg/L后再增加半胱氨酸含量對汞甲基化率提高的作用不明顯.半胱氨酸能夠影響微生物細胞內汞的甲基化作用,通過與汞形成一種可以透過細胞膜、容易進出細胞的絡合物,從而使能夠進入細胞內進行甲基化的汞含量提高,也就是說增加了細胞能利用的汞含量[9].Schaefer等[20]的研究表明半胱氨酸能夠提高甲基汞的生成量以及加快反應的進行,是因為半胱氨酸帶有-SH基團,與汞形成的絡合物在細胞膜上的傳輸不能單純地只以被動擴散來解釋,而是以某種未知的促進傳輸?shù)姆绞竭M行.Kelly等[23]和 Golding等[24]發(fā)現(xiàn)對于汞在細胞膜上的傳輸而言,促進吸收如被動擴散一樣,都是微生物會使用的細胞傳輸機制.

圖5 腐殖酸(HA)對S. oneidensis MR-1生物甲基化HgS的影響Fig.5 Effect of humic acid on HgS biological methylation by S. oneidensis MR-1

圖6 半胱氨酸(Cys)對S. oneidensis MR-1生物甲基化HgS的影響Fig.6 Effect of cysteine on HgS biological methylation by S. oneidensis MR-1

2.3.2 半胱氨酸(Cys)對S. oneidensis MR-1生物甲基化HgS的效應 當溫度30℃,腐殖酸濃度為 5mg/L,半胱氨酸濃度分別為 100,200,300, 400mg/L時,在S. oneidensis MR-1作用下,上清液中甲基汞含量隨時間的變化趨勢如圖 6所示.在不同濃度半胱氨酸存在時,甲基汞含量都在第

3 結論

3.1 S. oneidensis MR-1對固態(tài)硫化汞的生物溶解量隨腐殖酸濃度的增大而增大,但生物甲基化率在腐殖酸濃度為1～5mg/L范圍內呈上升趨勢,腐殖酸濃度為 5～10mg/L范圍內呈抑制作用,其中最大生物甲基化率達到10.55%.

3.2 加入不同濃度半胱氨酸,對 S. oneidensis MR-1生物溶解固態(tài)硫化汞的影響較小,但卻能增加菌體的生物甲基汞生成量,提高生物甲基化率,使汞甲基化率達到 19.23%,當半胱氨酸濃度超過300mg/L時, 促進汞生物甲基化作用不明顯.

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Effects of humic acid and cysteine on the biotransformation of HgS by Shewanella oneidensis MR-1.

CHEN Yan,

HUANG Xiao, SI You-bin*(School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：526～531

Effects of humic acid and cysteine on the biological dissolution and methylation of solid HgS by Shewanella oneidensis MR-1were studied. The results showed that the biological solubility of solid HgS was increased with the increasing humic acid concentration, and the concentration of dissolved HgS was 3.35mg/L at the humic acid concentration of 10mg/L. The biological methylation rate of HgS was rising at the humic acid concentration from 1 to 5mg/L, declining while the humic acid concentration from 5 to 10mg/L, and the highest methylation rate was about 10.55%. Cysteine added with different concentration had little influence on the biological solubility of solid HgS, but it could accelerate the methylation reaction process and increase the biological methylation rate of HgS by S. oneidensis MR-1up to 19.23%. The present study provided direct evidence for the biological dissolution and methylation of solid HgS by iron-reducing bacteria in the natural aquatic ecosystem.

iron reducing bacteria；HgS；biotransformation；humic acid；cysteine

X172

：A

：1000-6923(2014)02-0526-06

陳 艷(1987-),女,安徽淮南人,安徽農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院碩士研究生,研究方向為環(huán)境污染化學與控制工程.

2013-06-21

國家自然科學基金(40971182,41171254);財政部、環(huán)境保護部重金屬污染防治專項資金(財建[2010]375號)

* 責任作者, 教授, youbinsi@ahau.edu.cn