辛伐他汀片微生物限度檢查方法學驗證

王正鳳 翟靈妍 陳家香 吳 軍

(西南藥業(yè)股份有限公司 藥物研究所，中國 重慶400038)

《中國藥典》2 0 10版規(guī)定，當建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認所用的方法適合于該產(chǎn)品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。而對具有抑菌作用的產(chǎn)品，由于在試驗條件下存在對待檢菌的干擾，使檢查結(jié)果不能真實的反映藥品被污染微生物的量，必須采取一定的方法，如薄膜過濾法、培養(yǎng)基稀釋法、中和法或離心沉淀法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，使藥品的抑菌作用在該檢驗條件下無干擾或可以忽略不計，從而順利檢出供試品所污染的各種微生物，更好的控制藥品的質(zhì)量，保證人民的用藥安全。辛伐他汀是心血管類藥物，為使該藥品質(zhì)量得到較好的控制，筆者采用兩種方法來驗證辛伐他汀片微生物限度檢查法的專屬性和有效性。

1 實驗材料

1.1 供試樣品：辛伐他汀片（規(guī)格10mg，批號100901），西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（091102）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（090506）、改良馬丁培養(yǎng)基（091002）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（091203）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）(090701)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（100205）、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）（090302）。

1.3 供試菌種：大腸埃希菌（Escherichiacoli）［CMCC(B)44102］;金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［CMCC(B)26003］;枯草芽孢桿菌（Bacillussubtillis）［CMCC(B)63501］;白色念珠菌（Candidaalbicans）［CMCC(F)98001］;黑曲霉（Aspergillusniger）［CMCC(F)98003］。以上菌株由重慶藥品檢驗所提供。

1.4 稀釋劑及試劑：pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，靛基質(zhì)試劑，0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.5 儀器：生物潔凈安全柜、壓力蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、電子天平、酒精燈、培養(yǎng)皿、錐形瓶、移液管、微生物限度專用檢測室等。

2 方法

2.1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.1.1 菌液的制備：接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯中，在30-35℃下培養(yǎng)18～24h，吸取該培養(yǎng)液1ml，加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5-10-7，使溶液中菌數(shù)約為50-100cfu/ml。

接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，在23-28℃下培養(yǎng)18-24h，吸取該培養(yǎng)液1ml，加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5-10-7，使溶液中菌數(shù)約為50-100cfu/m l。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁斜面培養(yǎng)基上，在23-28℃下培養(yǎng)5-7d，加3-5ml0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4-10-6，使菌數(shù)約為 50-100cfu/ml。

2.1.2 培養(yǎng)基的制備：按照說明書進行配制后分裝滅菌備用。

2.1.3 供試液的配制：稱取供試品10g，加入pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，水浴加熱溶解，溫度不得過45℃，混勻，作為1:10的供試液。

2.1.4 計數(shù)方法的驗證（常規(guī)法）

1）試驗組

細菌數(shù)的測定：分別取上述1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，并分別加入上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌5 0-100cfu的試驗菌菌懸液1ml，立刻傾注1 5-20ml的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于30-35℃倒置培養(yǎng)2天。

霉菌及酵母菌數(shù)的測定：分別取上述1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，并分別加入上述白色念珠菌、黑曲霉50-100cfu的試驗菌菌懸液1ml，立刻傾注15-20ml的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于23-28℃倒置培養(yǎng)3天。

每株試驗菌平行制備2個平板，按平皿法測定其菌數(shù)。

2）菌液組

在無菌平皿中分別加入上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌50-100cfu的試驗菌菌懸液1ml，立刻傾注15-20ml的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于30-35℃倒置培養(yǎng)2天。

在無菌平皿中分別加入上述白色念珠菌、黑曲霉50-100cfu的試驗菌菌懸液1ml，立刻傾注15-20ml的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于23-28℃倒置培養(yǎng)3天。

3）供試品對照組

細菌數(shù)的測定：分別取上述1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，立刻傾注15-20ml的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于30-35℃倒置培養(yǎng)2天。

霉菌及酵母菌數(shù)的測定：分別取上述1:10供試液1ml，注入無菌平皿中，立刻傾注15-20ml的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于23-28℃倒置培養(yǎng)3天。

（4）稀釋劑對照組

用pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50-100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。

每處理3次重復，分別計算各試驗菌每次試驗的回收率，求其平均值。

結(jié)果表明，本品對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的抑菌作用不顯著，回收率均大于70%，可用常規(guī)法檢驗；對大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑菌作用，回收率均低于70%，因此首先采用培養(yǎng)基稀釋法。

2.1.5 計數(shù)方法的驗證（培養(yǎng)基稀釋法）

每組除供試液1ml和試驗菌1ml均等量分注5個無菌平皿中（每個均加0.2ml）外，其他每組操作同常規(guī)法。

結(jié)果表明：采用培養(yǎng)基稀釋法能夠有效的去除本品對大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用，試驗組及稀釋劑對照組菌液回收率均大于7 0%。

結(jié)論：確定本品的細菌數(shù)檢查采用培養(yǎng)基稀釋法測定，霉菌及酵母菌檢查采用常規(guī)法測定。

2.2 控制菌的驗證

按照《中國藥典》2010年版規(guī)定，本試驗所用樣品的控制菌檢查要求為每1g中不得檢出大腸埃希菌，按照規(guī)定，驗證大腸埃希菌選擇金黃色葡萄球菌作為陰性對照菌，因此驗證菌株為大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌。

2.2.1 菌液的制備：接種大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于30-35℃培養(yǎng)18-24h，再用0.9%無菌氯化鈉溶液按10倍系列稀釋成濃度為10-100cfu/m l的菌懸液。

2.2.2常規(guī)法：1）試驗組。取1:10供試液10ml（相當于1g供試樣品），加入1ml大腸埃細菌懸液（10-100cfu），接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于35-37℃下培養(yǎng)18-24h。2）陰性菌對照組。取供試液10ml和1ml金黃色葡萄球菌懸液（10-100cfu），接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于 5-37℃下培養(yǎng)18-24h。

試驗組和陰性菌對照組培養(yǎng)18-24h后，分別取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，分別于5和24h時在366nm紫外光下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，則MUG陽性；不呈熒光，則MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面若呈現(xiàn)玫瑰紅色，則為靛基質(zhì)陽性；若呈現(xiàn)試劑本色，則為靛基質(zhì)陰性。本底對照應為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。如試劑為MUG陽性，靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性，靛基質(zhì)陽性，則取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18-24h，觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查。試驗組未檢出試驗菌，應采用稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行驗證。

試驗結(jié)果：試驗組未檢出試驗菌，陰性菌對照組未檢出陰性菌。結(jié)果表明辛伐他汀片對大腸埃希菌有抑制作用，因此采用培養(yǎng)基稀釋法消除辛伐他汀片對大腸埃希菌的抑菌作用。

2.2.3 采用培養(yǎng)基稀釋法：試驗組。方法同以上控制菌檢查，區(qū)別在于取供試液10ml（相當于供試品1g）和1ml大腸菌懸液（10-100cfu）接種至250ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35-37℃培養(yǎng)18-24h，其余操作同上。

試驗結(jié)果：試驗組檢出試驗菌。說明培養(yǎng)基稀釋法可用于該樣品的控制菌檢測。

3 結(jié)論

該試驗按照《中國藥典》2010年版微生物限度檢查法中的常規(guī)法進行檢查，發(fā)現(xiàn)試驗組對金黃色葡萄球菌，白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均高于70%，而大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于70%，說明該供試品具有微弱的抑菌作用，而采用培養(yǎng)基稀釋法可消除其抑菌性。而控制菌的檢查采用培養(yǎng)基稀釋法時陽性菌生長良好，陰性菌金黃色葡萄球菌均未檢出，說明該控制菌檢查方法的專屬性好，可用于控制菌檢查。該試驗通過對辛伐他汀片的微生物限度檢查計數(shù)方法的驗證及控制菌檢查方法的驗證，證明了在處方、生產(chǎn)工藝不的情況下，采用培養(yǎng)基稀釋法可進行辛伐他汀片的微生物限度檢查。