辛伐他汀片微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證

王正鳳 翟靈妍 陳家香 吳 軍

(西南藥業(yè)股份有限公司 藥物研究所，中國(guó) 重慶400038)

《中國(guó)藥典》2 0 10版規(guī)定，當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定。而對(duì)具有抑菌作用的產(chǎn)品，由于在試驗(yàn)條件下存在對(duì)待檢菌的干擾，使檢查結(jié)果不能真實(shí)的反映藥品被污染微生物的量，必須采取一定的方法，如薄膜過(guò)濾法、培養(yǎng)基稀釋法、中和法或離心沉淀法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，使藥品的抑菌作用在該檢驗(yàn)條件下無(wú)干擾或可以忽略不計(jì)，從而順利檢出供試品所污染的各種微生物，更好的控制藥品的質(zhì)量，保證人民的用藥安全。辛伐他汀是心血管類(lèi)藥物，為使該藥品質(zhì)量得到較好的控制，筆者采用兩種方法來(lái)驗(yàn)證辛伐他汀片微生物限度檢查法的專(zhuān)屬性和有效性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 供試樣品：辛伐他汀片（規(guī)格10mg，批號(hào)100901），西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（091102）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（090506）、改良馬丁培養(yǎng)基（091002）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（091203）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）(090701)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（100205）、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）（090302）。

1.3 供試菌種：大腸埃希菌（Escherichiacoli）［CMCC(B)44102］;金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［CMCC(B)26003］;枯草芽孢桿菌（Bacillussubtillis）［CMCC(B)63501］;白色念珠菌（Candidaalbicans）［CMCC(F)98001］;黑曲霉（Aspergillusniger）［CMCC(F)98003］。以上菌株由重慶藥品檢驗(yàn)所提供。

1.4 稀釋劑及試劑：pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，靛基質(zhì)試劑，0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。

1.5 儀器：生物潔凈安全柜、壓力蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、電子天平、酒精燈、培養(yǎng)皿、錐形瓶、移液管、微生物限度專(zhuān)用檢測(cè)室等。

2 方法

2.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.1.1 菌液的制備：接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在30-35℃下培養(yǎng)18～24h，吸取該培養(yǎng)液1ml，加入9ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5-10-7，使溶液中菌數(shù)約為50-100cfu/ml。

接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，在23-28℃下培養(yǎng)18-24h，吸取該培養(yǎng)液1ml，加入9ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5-10-7，使溶液中菌數(shù)約為50-100cfu/m l。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁斜面培養(yǎng)基上，在23-28℃下培養(yǎng)5-7d，加3-5ml0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管）1ml加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4-10-6，使菌數(shù)約為 50-100cfu/ml。

2.1.2 培養(yǎng)基的制備：按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制后分裝滅菌備用。

2.1.3 供試液的配制：稱(chēng)取供試品10g，加入pH7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，水浴加熱溶解，溫度不得過(guò)45℃，混勻，作為1:10的供試液。

2.1.4 計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證（常規(guī)法）

1）試驗(yàn)組

細(xì)菌數(shù)的測(cè)定：分別取上述1:10供試液1ml，注入無(wú)菌平皿中，并分別加入上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌5 0-100cfu的試驗(yàn)菌菌懸液1ml，立刻傾注1 5-20ml的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于30-35℃倒置培養(yǎng)2天。

霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定：分別取上述1:10供試液1ml，注入無(wú)菌平皿中，并分別加入上述白色念珠菌、黑曲霉50-100cfu的試驗(yàn)菌菌懸液1ml，立刻傾注15-20ml的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于23-28℃倒置培養(yǎng)3天。

每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平板，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。

2）菌液組

在無(wú)菌平皿中分別加入上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌50-100cfu的試驗(yàn)菌菌懸液1ml，立刻傾注15-20ml的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于30-35℃倒置培養(yǎng)2天。

在無(wú)菌平皿中分別加入上述白色念珠菌、黑曲霉50-100cfu的試驗(yàn)菌菌懸液1ml，立刻傾注15-20ml的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于23-28℃倒置培養(yǎng)3天。

3）供試品對(duì)照組

細(xì)菌數(shù)的測(cè)定：分別取上述1:10供試液1ml，注入無(wú)菌平皿中，立刻傾注15-20ml的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于30-35℃倒置培養(yǎng)2天。

霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定：分別取上述1:10供試液1ml，注入無(wú)菌平皿中，立刻傾注15-20ml的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于23-28℃倒置培養(yǎng)3天。

（4）稀釋劑對(duì)照組

用pH7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50-100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。

每處理3次重復(fù)，分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率，求其平均值。

結(jié)果表明，本品對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的抑菌作用不顯著，回收率均大于70%，可用常規(guī)法檢驗(yàn)；對(duì)大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑菌作用，回收率均低于70%，因此首先采用培養(yǎng)基稀釋法。

2.1.5 計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證（培養(yǎng)基稀釋法）

每組除供試液1ml和試驗(yàn)菌1ml均等量分注5個(gè)無(wú)菌平皿中（每個(gè)均加0.2ml）外，其他每組操作同常規(guī)法。

結(jié)果表明：采用培養(yǎng)基稀釋法能夠有效的去除本品對(duì)大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用，試驗(yàn)組及稀釋劑對(duì)照組菌液回收率均大于7 0%。

結(jié)論：確定本品的細(xì)菌數(shù)檢查采用培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定，霉菌及酵母菌檢查采用常規(guī)法測(cè)定。

2.2 控制菌的驗(yàn)證

按照《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定，本試驗(yàn)所用樣品的控制菌檢查要求為每1g中不得檢出大腸埃希菌，按照規(guī)定，驗(yàn)證大腸埃希菌選擇金黃色葡萄球菌作為陰性對(duì)照菌，因此驗(yàn)證菌株為大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌。

2.2.1 菌液的制備：接種大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于30-35℃培養(yǎng)18-24h，再用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液按10倍系列稀釋成濃度為10-100cfu/m l的菌懸液。

2.2.2常規(guī)法：1）試驗(yàn)組。取1:10供試液10ml（相當(dāng)于1g供試樣品），加入1ml大腸埃細(xì)菌懸液（10-100cfu），接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于35-37℃下培養(yǎng)18-24h。2）陰性菌對(duì)照組。取供試液10ml和1ml金黃色葡萄球菌懸液（10-100cfu），接種至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于 5-37℃下培養(yǎng)18-24h。

試驗(yàn)組和陰性菌對(duì)照組培養(yǎng)18-24h后，分別取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，分別于5和24h時(shí)在366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，則MUG陽(yáng)性；不呈熒光，則MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面若呈現(xiàn)玫瑰紅色，則為靛基質(zhì)陽(yáng)性；若呈現(xiàn)試劑本色，則為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。如試劑為MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性，靛基質(zhì)陽(yáng)性，則取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18-24h，觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查。試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行驗(yàn)證。

試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，陰性菌對(duì)照組未檢出陰性菌。結(jié)果表明辛伐他汀片對(duì)大腸埃希菌有抑制作用，因此采用培養(yǎng)基稀釋法消除辛伐他汀片對(duì)大腸埃希菌的抑菌作用。

2.2.3 采用培養(yǎng)基稀釋法：試驗(yàn)組。方法同以上控制菌檢查，區(qū)別在于取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g）和1ml大腸菌懸液（10-100cfu）接種至250ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35-37℃培養(yǎng)18-24h，其余操作同上。

試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌。說(shuō)明培養(yǎng)基稀釋法可用于該樣品的控制菌檢測(cè)。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》2010年版微生物限度檢查法中的常規(guī)法進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌，白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均高于70%，而大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于70%，說(shuō)明該供試品具有微弱的抑菌作用，而采用培養(yǎng)基稀釋法可消除其抑菌性。而控制菌的檢查采用培養(yǎng)基稀釋法時(shí)陽(yáng)性菌生長(zhǎng)良好，陰性菌金黃色葡萄球菌均未檢出，說(shuō)明該控制菌檢查方法的專(zhuān)屬性好，可用于控制菌檢查。該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)辛伐他汀片的微生物限度檢查計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證及控制菌檢查方法的驗(yàn)證，證明了在處方、生產(chǎn)工藝不的情況下，采用培養(yǎng)基稀釋法可進(jìn)行辛伐他汀片的微生物限度檢查。