HPLC-ELSD法測定益氣軟皮丸中黃芪甲苷含量

羅 堃，王元清，謝 瑜，李順祥，嚴(yán)建業(yè)*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化教育廳重點實驗室, 湖南 長沙 410208；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)與工程實驗室，湖南 長沙 410004)

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HPLC-ELSD法測定益氣軟皮丸中黃芪甲苷含量

羅 堃1，王元清2，謝 瑜1，李順祥1，嚴(yán)建業(yè)1*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化教育廳重點實驗室, 湖南 長沙 410208；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)與工程實驗室，湖南 長沙 410004)

目的：建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法測定益氣軟皮丸中黃芪甲苷含量的方法。方法：采用Agilent TC-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈-水(32∶68)為流動相，流速為1.0mL·min-1，柱溫為30℃，漂移管溫度為100℃，載氣流速為2.5mL·min-1，進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果：黃芪甲苷在1.02～10.20μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=1.7281X+1.9515(r=0.9998)，平均回收率為97.59%，RSD為0.95%(n=6)。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡便、重復(fù)性好，可用于該制劑中黃芪甲苷含量的測定。

益氣軟皮丸；黃芪甲苷；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法；含量測定

益氣軟皮丸由黃芪、黨參、白術(shù)、紅花、當(dāng)歸等八味中藥組方而成，具有益氣補脾、活血化瘀、散寒除痹的功效[1]。該方為治療硬皮病的臨床經(jīng)驗方，方中黃芪為君藥，黃芪甲苷是其主要活性成分之一，具有抗心力衰竭、增強心肌收縮力、擴張血管及冠脈、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞及體液免疫、抗缺氧及抗疲勞等作用[2-5]。本文以黃芪甲苷為指標(biāo)，采用HPLC-ELSD法對其進(jìn)行含量測定，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 LC(安捷倫科技有限公司)，蒸發(fā)光散射檢測器(ALLtech 3300ELSD)；Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250mm，5μm)；電子分析天平T-214(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品(批號：110781-200613，中國食品藥品檢定研究院)；益氣軟皮丸(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，批號：20111201，20111205，20111209)。乙腈為色譜純，實驗用水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-水(38∶62)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；ELSD參數(shù)：漂移溫度100℃，載氣流速2.5L·min-1；理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4 000，色譜見圖1。

圖1 益氣軟皮丸中黃芪甲苷的HPLC圖譜

2.2 對照品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含0.51mg的溶液，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品研細(xì)，取其細(xì)粉約6g，精密稱定，加甲醇150mL，置水浴加熱回流1h，濾過，容器及濾渣用甲醇30mL分3次洗滌，濾液與洗液合并，蒸干，殘渣加水30mL，微熱使溶解，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次30mL，合并正丁醇萃取液，用氨試液分洗滌3次(每次40mL，每次振搖后靜置1h)，再用30mL水洗滌1次，水層棄去，正丁醇液置水浴上蒸至近干，殘渣加甲醇溶解后定容至10mL量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液制備

按處方組成和工藝要求制成不含黃芪的益氣軟皮丸(陰性樣品)，再按供試品溶液制備項下的方法制成陰性對照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

按照擬定的色譜條件，精密吸取“2.2”項下的對照品溶液2、4、8、12、16、20μL進(jìn)樣，測定峰面積，以進(jìn)樣量的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對照品峰面積的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得其回歸方程為：Y=1.7281X+1.9515(r=0.9998)，表明黃芪甲苷在1.02～10.20μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液(批號：20111201)，在擬定的色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量20μL，記錄黃芪甲苷峰面積，計算，得峰面積RSD=0.48%(n=6)。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

分別精密吸取同一供試品溶液(批號：20111201)20μL，分別于制備后0、2、4、8、12、24h依次進(jìn)樣，記錄黃芪甲苷峰面積，計算，得峰面積RSD=0.27%(n=6)。結(jié)果表明，樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批樣品(批號：20111201)按“2.3”項下方法制成6份供試品溶液，按上述擬定方法分別測定，計算黃芪甲苷平均含量，得平均含量為0.40mg/g，RSD=1.35%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品(批號：20111201，含量為0.40mg/g)約3g，精密稱定，平行6份，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液(0.528mg/mL)2.5mL，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，測定黃芪甲苷含量，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.10 含量測定

取3批樣品(批號：20111201，20111205，20111209)，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項色譜條件，精密進(jìn)樣20μL，記錄峰面積，采用外標(biāo)兩點法計算。結(jié)果三批益氣軟皮丸樣品中黃芪甲苷含量測定分別為0.2498、0.2823、0.2875mg/g。

3 討論

黃芪甲苷的最大吸收波長為200.8nm，在203nm波長處有末端吸收，若選擇紫外檢測器進(jìn)行測定，與溶劑峰、雜質(zhì)峰很難分離，難以進(jìn)行分析。而傳統(tǒng)的薄層掃描法影響因素更多，誤差相對更大。為更好控制益氣軟皮丸的質(zhì)量，本試驗參照2010年版《中國藥典》[6]，采用蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行測定，并進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)考察。試驗結(jié)果表明，該方法簡便、穩(wěn)定、可靠，可用于該制劑中黃芪甲苷含量的測定。

[1] 謝瑜,嚴(yán)建業(yè),李順祥.益氣軟皮丸的薄層鑒別研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2013,9(2)：39-41.

[2] 李絢,閻蓉華,羅照田,等.黃芪注射液對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用[J].華西藥學(xué)雜志,2005,20(1)：48-49.

[3] 張曉丹,劉琳,佟欣.黨參、黃芪對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的比較研究[J].中草藥,2003,34(9)：822-823.

[4] 周吉燕,樊懿,孔建龍,等.黃芪中不同提取成分對在體大鼠心肌缺血-再灌注損傷的心功能影響[J].中國中藥雜志,2000,25(5)：300-302．

[5] 劉天一,何觀虹,姚麗.黃芪甲苷治療心血管疾病研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2013,30(2)：117-120.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：283.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Determination of Astragnaloside A in Yiqi Ruanpi Pills by HPLC-ELSD

Luo Kun1， Wang Yuanqing2，Xie Yu1，Li Shunxiang1，Yan Jianye1*

(1.Key Lab of Modernization of Chinese Medicine, School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208，China; 2.Lab of Biotechnology and Engineering, College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004，China)

Objective:To establish HPLC-ELSD method for content determination of astragaloside A in Yiqi Ruanpi Pills.Methods:The separation was performed on Agilent TC-C18(250mm×4.6mm，5μm)column with acetonitrile water(32∶68)as mobile phase．The flow rate was 1.0 mL·min-1．The column temperature was 30℃．The temperature of drift tube for ELSD was set at 100℃ , the air flow rate was 2.5mL·min-1.Injection volume was 20μL. Results:The linear range of astragaloside A was 1.02～10.20μg，The regressive equation of tandard curve was Y=1.7281X+1.9515 (r=0.9998). The average recovery rate was 97.59%，RSD=0.95%(n=6).Conclusion:The method is simple and accurate，and has good reproducibility．It can be used as determination method of astragaloside IV in Yiqi Ruanpi Pills.of Yiqi Ruanpi Pill.

Yiqi Ruanpi Pills；Astragaloside A；HPLC-ELSD；content determination

2014-07-02

湖南省高校“中藥新藥創(chuàng)制與資源綜合持續(xù)利用”科技創(chuàng)新團隊項目(湘教通[2010]212號)；湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心項目(湘科計字[2013]83號)；湖南省“中藥學(xué)”重點學(xué)科項目(湘教通[2011]76號)

羅堃(1980-)，男，湖南中醫(yī)藥大學(xué)講師，研究方向為中藥制劑工藝及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

嚴(yán)建業(yè)(1975-)，男，湖南中醫(yī)藥大學(xué)副教授，研究方向為中藥制劑新技術(shù)。

R

A

1673-2197(2014)21-0002-02