血尿酸對(duì)大鼠阿爾茨海默病生物標(biāo)記物表達(dá)的影響☆

王君霞 劉慶新 肖新興

血尿酸對(duì)大鼠阿爾茨海默病生物標(biāo)記物表達(dá)的影響☆

王君霞*劉慶新*肖新興*

目的觀察不同血尿酸水平對(duì)大鼠阿爾茨海默病生物標(biāo)記物β-淀粉樣肽前體蛋白（amyloid recurosr protein，APP）及β分泌酶-1（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1）表達(dá)的影響。方法采用腹腔注射氧嗪酸鉀鹽（oxonic acid Potassiumsalt，OAPS）的方法建立不同水平高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）大鼠模型，HE染色觀察大鼠海馬區(qū)形態(tài)學(xué)變化；Western blot檢測(cè)海馬區(qū)APP及BACE1的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，OAPS處理組血尿酸水平明顯升高（P＜0.01），海馬區(qū)APP及BACE1的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001），與低劑量組比較，中、高劑量組血尿酸水平升高（P＜0.05），海馬區(qū)APP及BACE1表達(dá)減少（P＜0.05），與中劑量組比較，高劑量組血尿酸水平增高（P＜0.01），高劑量組的大鼠海馬組織APP的表達(dá)減少（P＜0.05），BACE1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性（P＞0.05）。結(jié)論高于正常水平的血尿酸可能為AD發(fā)生或發(fā)展的危險(xiǎn)因素，其水平越高對(duì)AD危險(xiǎn)性越低。

高尿酸血癥 β-淀粉樣肽前體蛋白 β分泌酶-1

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）是一種起病隱匿的以學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能進(jìn)行性下降為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變疾病。全球AD患者數(shù)量每20年增長(zhǎng)一倍[1]，AD的確切發(fā)病機(jī)制仍不明確，認(rèn)為是多種因素造成的共同結(jié)果。近來(lái)有研究表明，尿酸（uric acid，UA）在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起重要作用，但UA與AD之間的關(guān)系眾說(shuō)紛紜，未有定論。眾所周知，UA具有抗氧化和促氧化雙重性質(zhì)，UA對(duì)AD是保護(hù)因素，還是危險(xiǎn)因素，尚待明確。本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同水平血尿酸與AD的關(guān)系，為預(yù)防或治療AD提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的清潔級(jí)Wistar雄性健康大鼠48只，體重（220±10）g，SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，動(dòng)物自由飲水與飲食，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；每周稱重2次，根據(jù)體重隨時(shí)調(diào)整給藥量。

1.2 動(dòng)物分組與高尿酸血癥模型的建立將動(dòng)物隨機(jī)分成4組，即正常對(duì)照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組，每組12只大鼠。OAPS以滅菌蒸餾水配成300、600、900 mg/kg 3種劑量，采用腹腔注射的方法進(jìn)行，給藥體積1 mL/(100g·d)，正常對(duì)照組同時(shí)間腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù)給藥28d，各組動(dòng)物均實(shí)驗(yàn)條件下自然飲水、飲食。

1.3 血清指標(biāo)鑒定各組動(dòng)物分別于實(shí)驗(yàn)0、14、28 d采用斷尾取血法，采集大鼠血液約1 mL，經(jīng)室溫自然凝血和離心（3000 r/min，15 min）分離后，取上清液200 μL于EP管中，檢測(cè)血尿酸水平。

1.4 海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)28 d后，各組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行常規(guī)灌注取材，制作石蠟切片，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜選擇海馬區(qū)連續(xù)冠狀切片10張，片厚5 μm。常規(guī)脫水、二甲苯透明、封片，于光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5 Western blot檢測(cè)大鼠海馬區(qū)APP及BACE1的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)28 d后，各組選6只大鼠，冰上取分離海馬組織，用細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）提取海馬蛋白，使用10%SDS-PAGE分離，Semi-Dry Cell進(jìn)行半干電泳轉(zhuǎn)移，0.01 mol/L PBS稀釋一抗（GAPDH，Sigma，稀釋比例1：4000；兔抗APP、BACE1，Bioss，稀釋比例均為1：500）4℃溫育過(guò)夜，加入二抗（Jackson，稀釋比例1：2000）室溫溫育2 h，采用SuperSignal West Pico Chemiluminent Substrates進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，用Gel-Pro Analyzer軟件分析處理。GAPDH作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和分析。計(jì)量資料以（±s）表示，四組資料比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物血清尿酸水平的變化實(shí)驗(yàn)0 d，各組之間大鼠血UA水平相比較無(wú)明顯差異性（F= 0.272，P＞0.05），OAPS干預(yù)后，于實(shí)驗(yàn)14、28 d檢測(cè)各組大鼠血UA水平出現(xiàn)差異（F=297.737，P＜0.001；F=483.507，P＜0.001），與低劑量組比較，中劑量組及高劑量組的大鼠血UA水平明顯升高（P＜0.01）；與中劑量組比較，高劑量組的大鼠血UA水平顯著增高（P＜0.05），見表1。

2.2 大鼠海馬區(qū)形態(tài)學(xué)變化如圖1所示，正常對(duì)照組大鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，未見明顯病理改變。低、中、高劑量組大鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)異常，神經(jīng)細(xì)胞排列不規(guī)則，胞核固縮，染色加深。

2.3 海馬組織APP、BACE1的表達(dá)各組之間大鼠海馬組織APP、BACE1的表達(dá)有明顯差異性（F1=26.85，P1＜0.001；F2=10.969，P2＜0.001），與低劑量組比較，中劑量組及高劑量組的大鼠海馬組織APP、BACE1的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組的大鼠海馬組織APP的表達(dá)減少（P＜0.05），BACE1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見表2和圖2）。

表1 各組血清尿酸值的比較(c/mmol·L-1)

3 討論

到目前為止，AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)生存在多種假說(shuō)，但均與Aβ腦內(nèi)異常沉積相關(guān)聯(lián)，Aβ沉積是AD病理改變的中心環(huán)節(jié)[2]，Aβ是APP經(jīng)BACE1水解生成。APP是一種在人體的多種組織中廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白，是構(gòu)成SP的主要成分Aβ的前體蛋白，當(dāng)APP的表達(dá)升高將會(huì)導(dǎo)致Aβ的生成增多。諸多證據(jù)顯示，Aβ是由BACE1啟動(dòng)生成的，BACE1過(guò)表達(dá)，活性增強(qiáng)，可以使APP水解生成Aβ增多，導(dǎo)致AD的發(fā)生[3-4]，為Aβ生成的關(guān)鍵酶[5]。由此可見，AD的生物標(biāo)記物Aβ1-42、APP及BACE1的表達(dá)增多是AD發(fā)生和進(jìn)行性發(fā)展的重要因素。因此，選取Aβ1-42、APP及BACE1作為判斷AD發(fā)生和發(fā)展的生物標(biāo)記物，能更清晰的說(shuō)明不同水平血UA與AD的關(guān)系。

本研究通過(guò)采用腹腔注射OAPS成功復(fù)制HUA大鼠模型[6-7]。結(jié)果顯示，HUA大鼠海馬組織APP及BACE1的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯上調(diào)，隨著血尿酸水平的升高，大鼠海馬組織APP及BACE1的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，中、高劑量組BACE1表達(dá)無(wú)明顯差別。

由此可見，血UA與AD具有密切的相關(guān)性，高于正常水平的血UA可以使Aβ生成增多，促進(jìn)AD的發(fā)生或發(fā)展，成為AD的危險(xiǎn)因素之一，但隨著血UA水平的明顯升高，Aβ生成相對(duì)減少，血UA又可以降低AD的危險(xiǎn)性。

現(xiàn)已有大量研究證明，HUA與痛風(fēng)、高血壓、糖尿病、心血管疾病及腦小血管病等多種臨床疾病有關(guān)[8-9]。因此，血UA的相關(guān)研究得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。UA是人體內(nèi)嘌呤的最終代謝產(chǎn)物，是由嘌呤核苷酸經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)最終生成。它是一種特有的天然抗氧化劑，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞不被自由基損傷[10]。UA清除體內(nèi)自由基的作用與維生素C和維生素E相同，他們?cè)谘獫{中協(xié)同發(fā)揮抗氧化劑的功能[11]。UA還具有保護(hù)DNA、增強(qiáng)免疫功能、維持血壓和抗衰老的作用。但是，也有研究表明，UA還具有促氧化特性，溶解狀態(tài)的尿酸可以通過(guò)一系列反應(yīng)生產(chǎn)自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的增加[12]。它還可以介導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷，發(fā)揮促氧化性質(zhì)，我們前期臨床研究也證明：血UA水平增高是腦白質(zhì)病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。

表2 大鼠海馬組織APP、BACE1的表達(dá)

圖1 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)H＆E染色（400×）

圖2 大鼠海馬組織APP表達(dá)的影響（1：低劑量組，2：中劑量組，3：高劑量組，4：正常對(duì)照組）

Annanmaki T等[13]研究表明，低水平的血UA增加帕金森病（Parkinson's isease,PD）的風(fēng)險(xiǎn)性，血UA水平可作為預(yù)測(cè)認(rèn)知變化的指標(biāo)。商秀麗等[14]通過(guò)檢測(cè)30例AD患者和30例健康對(duì)照組的血UA水平，研究結(jié)果顯示，血UA可能是AD的危險(xiǎn)因素，血UA水平可能與AD的認(rèn)知功能有關(guān)。這都表明UA與AD的密切關(guān)系，結(jié)果也證實(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)論，即高于正常水平的血UA可能促進(jìn)AD的發(fā)生或發(fā)展。但血UA對(duì)AD的危險(xiǎn)性隨UA水平升高而降低，以前未見研究報(bào)道。

其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，提示血UA水平不同，在體內(nèi)所發(fā)揮的作用不盡相同。當(dāng)血UA水平過(guò)高時(shí)，UA主要發(fā)揮抗氧化特性，可以消除自由基及活性氧避免發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并可能分解過(guò)氧化物阻斷過(guò)氧化鏈，減輕大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞損傷，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用；當(dāng)血UA水平過(guò)低時(shí)，UA主要起促氧化特性，觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重AD的發(fā)生或發(fā)展，增加AD的危險(xiǎn)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，OAPS處理組大鼠海馬組織APP及BACE1表達(dá)明顯增多，推測(cè)血UA可能與AD的發(fā)生或發(fā)展密切相關(guān)，也許為AD的危險(xiǎn)因素之一。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同血UA水平與AD存在量效關(guān)系，血UA在一定的范圍內(nèi)對(duì)AD的危險(xiǎn)性較小，可以改善AD病情的進(jìn)展，這可能是由UA的抗氧化及促氧化雙重性質(zhì)決定。雖然，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的UA對(duì)AD具有不同的影響，但對(duì)于弄清UA具體劑量范圍的作用還需更多的研究，從而調(diào)控血UA水平，找到一個(gè)最佳濃度范圍，使尿酸既可以使AD處于低風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)，延緩AD病情的進(jìn)一步發(fā)展，同時(shí)又可以使其他相關(guān)疾病病情穩(wěn)定，達(dá)到最大利益化。這將是我們?cè)谝院蠊ぷ髦醒芯康姆较蚝椭攸c(diǎn)。

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The effects of serum uric acid on expression of APP and BACE1 in rats.

WANG Junxia,LIU Qingxin,XIAO
Xinxing.Department of Neurology,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256600,China.Tel：0535-3399999.

ObjectiveTo observe the effects of the different serumuric acid levels on expression of Alzheimer’s disease biomarkers(APP and BACE1)in rats.MethodsIntraperitoneal injection of oxygen of oxazine acid potassiumwas used to produce HUA models in rats.H&E staining was used to detect the morphological changes of the hippocampus. Western blot was used to detect the protein levels of APP and BACE1 of the hippocampus.ResultsCompared with normal control group,the serumuric acid and the protein levels of APP and BACE1 in the hippocampus was obviously increased at OAPS treatment group(P＜0.01).Compared with lowdose OAPS treatment group,the serumuric acid level was significantly increased whereas the protein levels of APP and BACE1 in the hippocampus were significantly decreased at the middle and high dose group(P＜0.01).Compared with middle dose group,the serumuric acid level was increased at high dose group(P＜0.05)and the expression of APP were decreased in the hippocampus rats but the expression of BACE1 remained unchanged(P＞0.05).ConclusionThe higher level of serumuric acid may be a protective factor of AD. The higher serumuric acid levels,the lower the risk of AD.

Hyperuricemia Amyloid recurosr protein Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1

R742

A

2014-03-17）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.08.007

☆山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：J12LL04）

*濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（濱州256600）