山東半島地區(qū)雙相情感障礙20號(hào)染色體基因掃描研究☆

欒萌 石姍姍 陳星 周鵬 常學(xué)潤(rùn) 王元訓(xùn) 陳剛

山東半島地區(qū)雙相情感障礙20號(hào)染色體基因掃描研究☆

欒萌*石姍姍△陳星*周鵬*常學(xué)潤(rùn)※王元訓(xùn)※陳剛*

目的 通過(guò)基因組掃描研究，在山東半島地區(qū)人群20號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)與雙相情感障礙關(guān)聯(lián)的易感基因位點(diǎn)。方法采集104例雙相情感障礙患者與1000名正常對(duì)照者的外周血液標(biāo)本，分別建立患者組與對(duì)照組的兩個(gè)DNA混合池樣本；采用覆蓋整個(gè)20號(hào)染色體并且間隔大約10 cM的13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，應(yīng)用Gene Mapper 4.0分別對(duì)兩個(gè)樣本進(jìn)行基因組掃描分析；使用CLUMP軟件對(duì)兩組等位基因頻率進(jìn)行比較。結(jié)果患者組與對(duì)照組在20號(hào)染色體上20p12.2（D20S186）區(qū)域的等位基因相對(duì)數(shù)目有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.022）。結(jié)論山東半島地區(qū)人群位于20號(hào)染色體上的20p12.2與雙相情感障礙易感性存在關(guān)聯(lián)，下一步將對(duì)該區(qū)域進(jìn)行精細(xì)定位，并探索可能存在的易感基因。

雙相情感障礙 染色體 基因組 關(guān)聯(lián)

雙相情感障礙（bipolar disorder，BD）是一種復(fù)雜的多基因遺傳性疾病[1-3]。目前已經(jīng)在歐美人群發(fā)現(xiàn)許多與BD關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域及可能的易感基因，然而由于存在遺傳異質(zhì)性，不同的國(guó)家、地域、種族人群的研究結(jié)果往往不盡相同。20號(hào)染色體與BD關(guān)聯(lián)區(qū)域主要集中在20q12、20q13.31、20p11.2-q11.2等區(qū)域[4-6]，但目前尚未見(jiàn)中國(guó)人群中有關(guān)20號(hào)染色體的研究報(bào)道。為探尋中國(guó)人群中與BD相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域及易感基因位點(diǎn)，本研究選取山東半島地區(qū)BD患者及正常對(duì)照者，在20號(hào)染色體應(yīng)用13個(gè)間隔大約10 cM遺傳距離的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行基因掃描。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象患者組為2005年至2009年山東省精神衛(wèi)生中心住院的雙相情感障礙I型患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）雙相情感障礙Ⅰ型診斷標(biāo)準(zhǔn)，漢族，發(fā)病年齡≤20歲。排除患嚴(yán)重軀體疾病者。在入選的104例患者中，男74例，女30例，年齡14～65歲，平均（26.13±10.94）歲。

對(duì)照組來(lái)自健康獻(xiàn)血者（山東省血液中心提供）。入選標(biāo)準(zhǔn)：漢族，無(wú)精神疾病史或精神疾病家族史。排除患嚴(yán)重軀體疾病者。共收集1000名對(duì)照，其中男669名，女331名，年齡17～55歲，平均（25.08±5.67）歲。兩組之間年齡（t=1.983，P= 0.106）、性別（χ2=0.775，P=0.379）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

全部受試者對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書，且本研究得到山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)的審核通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及混合池的構(gòu)建 所有研究對(duì)象抽取外周靜脈血5mL，EDTA抗凝處理，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用常?guī)酚—氯仿法提取患者組與對(duì)照組外周血基因組DNA。應(yīng)用DU 530紫外分光光度計(jì)檢測(cè)患者組和對(duì)照組的DNA濃度，將全部研究對(duì)象的DNA樣本稀釋至20 ng/μL。取患者組所有患者基因組DNA樣本各10μL進(jìn)行混合，然后充分混勻，建立患者組DNA混合池；同樣的方法建立對(duì)照組DNA混合池。以患者組和對(duì)照組DNA混合池作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.2 遺傳位點(diǎn)引物的選取和PCR擴(kuò)增 根據(jù)Linkage Mapping Set 2.5套裝試劑盒，在20號(hào)染色體上選擇13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，分別為D20S117、D20S889、D20S115、D20S186、D20S112、D20S195、D20S107、D20S119、D20S178、D20S196、D20S100、D20S171、D20S173，覆蓋整個(gè)20號(hào)染色體，遺傳間距約為10 cM，以3種不同顏色的熒光加以標(biāo)記區(qū)分。使用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）9700 DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。總反應(yīng)體系15μL：濃度為20 ng/μL的基因組DNA混合池模板3μL，引物1μL，Trans PCR SuperMix 9μL，Tag Gold聚合酶（美國(guó)Roche）0.1μL，去離子水2μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性11min；94℃變性30s；55～59℃退火1min；72℃延伸1min（總共30個(gè)循環(huán)）；60℃延伸60min。最后放置4℃冰箱保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳及基因分型 PCR擴(kuò)增完成后，在Avant-3130毛細(xì)管電泳儀上使用96孔板對(duì)兩組PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。在相鄰兩個(gè)孔道中分別加入患者組和對(duì)照組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4μL，再加入甲酰胺9μL和Liz-500橙色熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)0.2μL，充分混勻。將96孔板放入ABI 9700 DNA擴(kuò)增儀中95℃變性5min后，馬上置于冰盒上3 min，之后上樣電泳。電泳結(jié)束后應(yīng)用GeneMapper 4.0軟件對(duì)兩組電泳圖譜分別進(jìn)行基因分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法經(jīng)基因分型分析，可獲得一系列等位基因構(gòu)成的圖譜（allele image pattern，AIP），每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的AIP圖譜中峰型的數(shù)量反映DNA混合池樣本中等位基因數(shù)量，峰高則反映相對(duì)應(yīng)等位基因的頻率。對(duì)各位點(diǎn)等位基因峰圖進(jìn)行分析時(shí)，首先計(jì)算每個(gè)等位基因占該位點(diǎn)所有等位基因的比值，即每個(gè)等位基因峰值與該位點(diǎn)所有等位基因峰值總和之比，該比值也代表相應(yīng)等位基因在DNA混合池樣本中的頻率。然后計(jì)算每個(gè)等位基因的相對(duì)數(shù)目,人類細(xì)胞為二倍體，104例患者樣本在每個(gè)遺傳位點(diǎn)上即有208個(gè)等位基因（同理,對(duì)照組為2000個(gè)等位基因），將上述各組比值乘以相應(yīng)等位基因總數(shù)即得到每個(gè)等位基因相對(duì)數(shù)目。采用CLUMP軟件，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析等位基因相對(duì)數(shù)目差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終得到20號(hào)染色體上D20S117、D20S889、D20S115、D20S186、D20S112、D20S195、D20S107、D20S119、D20S178、D20S196、D20S100、D20S171、D20S173等13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因圖譜，分型結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，在D20S186（20p12.2）微衛(wèi)星位點(diǎn)共得到12個(gè)等位基因片段，其長(zhǎng)度分別為113 bp、115 bp、119 bp、121 bp、123 bp、125 bp、127 bp、129 bp、131 bp、133 bp、135 bp與137 bp，見(jiàn)圖1?；颊呓M與對(duì)照組在該位點(diǎn)的等位基因相對(duì)數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 22.112，P=0.022）。其他12個(gè)位點(diǎn)等位基因相對(duì)數(shù)目在組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

3 討論

國(guó)際上近年來(lái)已經(jīng)開(kāi)展許多關(guān)于BD的全基因組掃描研究，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與BD相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域，主要包括2q22-q24、6q23-q24、10q21、12p13.3、16p12、18p、21q22.13、22q12.1、Xq28等[7-11]。然而，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)類似的研究和報(bào)道。本研究應(yīng)用DNA混合池技術(shù)對(duì)BD患者進(jìn)行全基因組掃描，該技術(shù)是由Barcellos等[12]設(shè)計(jì)，后來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)化方法在歐洲十多個(gè)國(guó)家對(duì)多發(fā)性硬化的全基因組基因進(jìn)行掃描，進(jìn)一步證實(shí)這種方法的有效性[13,14]。本課題組在既往研究中成功采用該方法對(duì)精神分裂癥等多基因遺傳病進(jìn)行全基因組掃描及關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與精神分裂癥相互關(guān)聯(lián)的陽(yáng)性位點(diǎn)，并且在關(guān)聯(lián)區(qū)域周圍選擇多個(gè)候選基因進(jìn)行篩選與驗(yàn)證[15-19]。

碳酸鋰廣泛用于BD的治療，其主要通過(guò)抑制肌醇-1-磷酸酶而引起肌醇-1-磷酸的蓄積，使神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)消旋肌醇耗竭，最終導(dǎo)致磷酸肌醇（phosphoinositide，PI）通路失敏而發(fā)揮作用。在BD患者的血小板中，凝血酶所誘導(dǎo)的與PI通路有關(guān)的鈣代謝動(dòng)員活動(dòng)顯著加強(qiáng)。此外，對(duì)大腦組織和外周血細(xì)胞等研究的結(jié)果均提示細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)異?？赡芘cBD的病理生理過(guò)程密切相關(guān)[20]。Le等[21]和Ram等[22]檢測(cè)PI通路的重要侯選基因Gs蛋白α亞單位的基因，該基因定位于20q13區(qū)，但未發(fā)現(xiàn)該基因存在突變。

之后陸續(xù)有研究報(bào)道20號(hào)染色體與BD的關(guān)系。Willour等[4]對(duì)56個(gè)BD家系中354名成員采用107個(gè)微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記進(jìn)行研究，多點(diǎn)非參數(shù)連鎖分析結(jié)果證實(shí)3個(gè)區(qū)域的優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)（logarithm of odds，LOD）值大于1，并且最終發(fā)現(xiàn)20q12是連鎖區(qū)域。然而，Hamshere等[5]對(duì)383例患病同胞進(jìn)行連鎖分析，未能重復(fù)這一結(jié)果，卻發(fā)現(xiàn)另一個(gè)連鎖區(qū)域——20q13.31。但本研究中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)位于上述連鎖區(qū)域的微衛(wèi)星標(biāo)記D20S107、D20S171、D20S173與BD存在關(guān)聯(lián)，這可能是不同地區(qū)和種族人群的遺傳背景差異造成的。

表1 雙相情感障礙20號(hào)染色體13個(gè)微衛(wèi)星遺傳位點(diǎn)掃描結(jié)果

圖1 DNA混合池在D20S186位點(diǎn)的掃描圖譜橫坐標(biāo)表示等位基因片段長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。斜線上方數(shù)字表示電泳激發(fā)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，下方數(shù)字表示等位基因片段長(zhǎng)度。A圖為雙相情感障礙患者組等位基因圖譜，B圖為對(duì)照組等位基因圖譜

本研究與瑞士Radhakrishna等[6]的研究結(jié)果非常接近。該研究分析一個(gè)來(lái)自土耳其的常染色體顯性的BD大家系，在這個(gè)家系中共有13例患者，發(fā)病年齡從15歲至40歲不等；對(duì)230個(gè)遺傳標(biāo)記進(jìn)行全基因組掃描，隨后進(jìn)行全基因組連鎖分析；結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性區(qū)域?yàn)?0p11.2-q11.2，并且在D20S604、D20S470、D20S836、D20S838等4個(gè)位點(diǎn)得到LOD值4.34；單倍型分析將陽(yáng)性區(qū)域定位在D20S186和D20S109兩個(gè)位點(diǎn)之間（大約42 cM的遺傳間距）[6]。這與本研究發(fā)現(xiàn)的D20S186位點(diǎn)相吻合。隨后，Detera-Wadleigh等[23]和Oedegaard等[24]在BD家系研究中也得到類似的結(jié)果。

總之，本研究通過(guò)基因組掃描發(fā)現(xiàn)，位于20號(hào)染色體的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記D20S186的20p12.2區(qū)域與BD相關(guān)，在20p12.2區(qū)域周圍可能存在致病因子，這在國(guó)內(nèi)尚屬首次報(bào)道。由于本研究的對(duì)象僅限于山東地區(qū)，且樣本量有限，因此要做出肯定的結(jié)論，尚需進(jìn)一步加大樣本量以及在不同的地區(qū)和人群中開(kāi)展更為深入和細(xì)致的研究。我們下一步將選擇高密度遺傳標(biāo)記在D20S186位點(diǎn)附近進(jìn)行精細(xì)定位；同時(shí)開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、甲基化以及動(dòng)物模型的研究，采用交叉策略篩查雙相情感障礙的病因。

[1] Gonzalez S,Camarillo C,Rodriguez M,et al.A genome-wide linkage scan of bipolar disorder in Latino families identifies susceptibility lociat 8q24 and 14q32[J].Am J Med Genet B NeuropsychiatrGenet,2014,165(6):479-491.

[2] Nurnberger J,Miller M,Bowman E,etal.Genome-wide association study of irritable vs.elated mania suggests genetic differences between clinical subtypes of bipolar disorder[J].P LoS One,2013,8(1):e53804.

[3] Abou Jamra R,Fuerst R,Kaneva R,etal.The firstgenomewide interaction and locus-heterogeneity linkage scan in bipolar affective disorder:strong evidence of epistatic effects between loci on chromosomes 2q and 6q[J].Am J Hum Genet,2007,81(5): 974-986.

[4] Willour VL,Zandi PP,Huo Y,et al.Genome scan of the fifty-six bipolar pedigrees from the NIMH genetics initiative replication sample:chromosomes 4,7,9,18,19,20,and 21[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet,2003,121B(1):21-27.

[5] Hamshere ML,Schulze TG,Schumacher J,et al.Mood-incongruent psychosis in bipolar disorder:conditional linkage analysis shows genome-wide suggestive linkage at 1q32.3,7p13 and 20q13.31[J].Bipolar Disord,2009,11(6):610-620.

[6] Radhakrishna U,Senol S,Herken H,et al.An apparently dominant bipolar affective disorder(BPAD)locus on chromosome 20p11.2-q11.2 in a large Turkish pedigree[J].Eur J Hum Genet,2001,9(1):39-44.

[7] Greenwood TA,Akiskal HS,Akiskal KK,et al.Genome-wide association study of temperament in bipolar disorder reveals significant associations with three novel Loci[J].Biol Psychiatry, 2012,72(4):303-310.

[8] Greenwood TA,Nievergelt CM,Sadovnick AD,etal.Further evidence for linkage of bipolar disorder to chromosomes 6 and 17 in a new independent pedigree series[J].Bipolar Disord,2012,14(1):71-79.

[9] Meier S,Mattheisen M,Vassos E,et al.Genome-wide significant association between a'negativemood delusions'dimension in bipolar disorder and genetic variation on chromosome 3q26.1 [J].Transl Psychiatry,2012,2(1):e165.

[10] Barnett JH,Smoller JW.The genetics of bipolar disorder[J]. Neuroscience,2009,164(1):331-343.

[11] Craddock N,Sklar P.Genetics of bipolar disorder:successful start to a long journey[J].Trend Genet,2009,25(2):99-105.

[12] Barcellos LF,Klitz W,Field LL,et al.Association mapping of disease loci,by use of a pooled DNA genomic screen[J].Am J Hum Genet,1997,61(3):734-747.

[13] Goertsches R,Villoslada P,Comabella M,et al.A genomic screen of Spanishmultiple sclerosis patients revealsmultiple lociassociated with the disease[J].J Neuroimmunol,2003,143(1): 124-128.

[14] Laaksonen M,Jonasdottir A,Fossdal R,et al.A whole genome association study in Finnish multiple sclerosis patients with 3669markers[J].J Neuroimmunol,2003,143(1-2):70-73.

[15] 魏然,周鵬,溫曉燕,等.山東半島東部地區(qū)精神分裂癥8號(hào)染色體基因掃描研究[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2007, 33(2):77-81.

[16] 陳剛,溫曉燕,朱海寧等.山東省濰坊東部地區(qū)精神分裂癥1號(hào)染色體基因掃描研究[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2007,24(3):288-292.

[17] 朱海寧,陳剛,溫曉燕,等.山東省濰坊市東部地區(qū)精神分裂癥患者6號(hào)染色體的基因組掃描研究[J].中華精神科雜志,2007,40(2):82-85.

[18] 欒萌,唐劍,陳星,等.兒童青少年精神分裂癥與GRM5基因的全基因組關(guān)聯(lián)分析和家系對(duì)照研究[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2011,37(6):366-369.

[19] Liu Y,Chen G,Norton N,et al.Whole genome association study in a homogenous population in Shandong peninsula of China reveals JARID2 as a susceptibility gene for schizophrenia[J]. J Biomed Biotechnol,2009,2009:536918.

[20] Kato T.Molecular genetics of bipolar disorder[J].Neurosci Res, 2001,40(2):105-113.

[21] Le F,Mitchell P,Vivero C,et al.Exclusion of close linkage of bipolar disorder to the Gs-alpha subunit gene in nine Australian pedigrees[J].J Affect Disord,1994,32(3):187-195.

[22] Ram A,Guedj F,Cravchik A,et al.No abnormality in the gene for the G protein stimulatory alpha subunit in patientswith bipolar disorder[J].Arch Gen Psychiatry,1997,54(1):44-48.

[23] Detera-Wadleigh SD,Badner JA,Yoshikawa T,et al.Initial genome scan of the NIMH genetics initiative bipolar pedigrees: chromosomes 4,7,9,18,19,20,and 21q[J].Am J Med Genet, 1997,74(3):254-262.

[24] Oedegaard KJ,Greenwood TA,Lunde A,et al.A genome-wide linkage study of bipolar disorder and co-morbidmigraine:replication of migraine linkage on chromosome 4q24,and suggestion of an overlapping susceptibility region for both disorders on chromosome 20p11[J].J Affect Disord,2010,122(1-2):14-26.

Localization of genetic susceptibility loci for bipolar disorder on chromosome 20 in Shandong peninsular.

LUAN Meng,SHI Shanshan,CHEN Xing,ZHOU Peng,CHANG Xuerun,WANG Yuanxun,CHEN Gang.
Laboratory of Medical Geneitcs,Institute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,18877 Jingshi road,Jinan 250062, China.Tel:0531-82919720.

ObjectiveTo identify the genetic lociassociated with bipolar disorder in Chinese population by the genome scan on chromosome 20 in bipolar disorder patients and healthy people from Shandong peninsula.MethodGenotyping was conducted on DNA pool samples of 104 bipolar disorder patients and 1000 controls using thirteenmicrosatellitemarkers on chromosome 20 spaced at intervals of approximately 10 cM and GeneMapper 4.0 s of tware.CLUMP s of tware was used to analyzemultiallelic markers.ResultSignificant difference of allele frequencies was found atmarkerD20S186(20p12.2)between patients and controls(P=0.022).ConclusionThe data suggest that theD20S186locus (20p12.2)is significantly associated with susceptibility to bipolar disorder in a Chinese Han population in Shandong peninsula.Future studies should focus on the finemapping of this region and assessment of candidate genes.

Bipolar disorder Chromosome Genome Association

R749.4

A

2014-09-09）

（責(zé)任編輯：肖雅妮）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.12.007

☆國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30770780）；山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（編號(hào)：ZR2014HQ030，ZR2014HQ042）；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013WS0364）

*山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室（濟(jì)南 250062）

△山東大學(xué)齊魯醫(yī)院老年病科

※山東省精神衛(wèi)生中心