SIRT1、p53、Ki—67在結直腸癌中的表達及意義

康軍朋等

【摘 要】目的：研究SIRT1在結直腸癌中的表達情況，分析它與臨床病理學特征及相關基因表達水平的關系，以期探討結直腸癌發生和發展的機制。方法：應用免疫組化Envision兩步法檢測60例結直腸癌組織和30例正常結直腸黏膜組織中SIRT1的表達情況，分析SIRT1的臨床病理學意義，以及與p53、Ki-67之間的相互關系。結果：60例結直腸癌中，SIRT1在結直腸癌中的陽性表達率高于正常結直腸黏膜（P<0.05）。SIRT1表達與結直腸癌浸潤深度（P=0.021）、淋巴結轉移（P=0.020）、pTNM分期（P=0.003）、p53的表達（P=0.024）、Ki-67的表達（P=0.021）均呈正相關，SIRT1在有淋巴結轉移組中的陽性表達率高于無淋巴結轉移組，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論：SIRT1在結直腸癌組織中呈高表達，且與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期有關，SIRT1的表達與p53、Ki-67的表達呈正相關，提示SIRT1可能參與結直腸癌的發生發展，并可能成為判定結直腸癌惡性程度及評估手術治療患者預后的生物學指標，聯合檢測SIRT1、p53和Ki-67的表達對評估結直腸癌患者的病情提供一定的理論依據，并可作為有效的治療靶點。

【關鍵詞】SIRT1；結直腸腫瘤；p53；Ki-67

【中圖分類號】R735.5 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）04-2069-02

結直腸癌（colorectal cancer， CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤中的發病率已位居第3位[1]，侵襲和轉移仍然是其不良預后的主要原因，其轉移的潛在性通常難以預測，尚缺乏有效的早期診斷手段，嚴重危害人民的健康。沉默信息調節因子1（sirtuin type 1，SIRT1）是目前腫瘤學研究的熱點基因之一，是依賴于NAD+的Ⅲ類組蛋白脫乙酰酶，是Sir2的哺乳動物同源物，在體內通過去乙酰化修飾作用，調節基因表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞生物學過程。近年研究發現，SIRT1蛋白在多種實體瘤中高表達，它可通過凋亡相關因子p53[2]途徑調節多種生理學底物，如HIC1、FOXO、DBC1等的轉錄、翻譯，還可以通過調節基質金屬蛋白酶2[3]（Matrix metalloproteinase-2）、C-MYC[4]等、沉默抑癌基因[5]、促進多藥耐藥基因（MDR1）的表達[6]影響細胞壽命，進而參與腫瘤的發生發展與耐藥以及腫瘤細胞的浸潤轉移。本研究應用免疫組化染色方法，檢測SIRT1在結直腸癌及癌旁正常組織中的表達，分析其與臨床病理參數的關系，探討SIRT1在結直腸癌發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象：收集2007年3月至2012年4月在保定市第一中心醫院行手術切除的結直腸癌存檔蠟塊60例為實驗組及結直腸鏡活檢證實為正常的結直腸黏膜30例為對照組，所有CRC患者診斷明確，術前均未行任何放化療及內分泌治療，均經外科手術切除后送檢病理檢查，證實為原發性CRC，且為首發，均未合并心臟病、腦血管疾病及其他系統疾病，病理資料完整。兩組病例的性別、年齡之間比較差異均無統計學意義。實驗組男性33例，女性27例；結腸35例，直腸25例；年齡23-77歲，平均年齡54.7±11.6歲；所有病例資料完整，包括血清CEA值。全部標本術后立即取材，經10%中性福爾馬林液固定，常規處理后石蠟包埋。

1.2 免疫組化：采用Envision兩步法。將石蠟切片中仍能見到癌組織的石蠟切片做SIRT1指標的免疫組織化學檢測，通過對病例資料進行查漏登記，發現有些病例免疫組化結果中無p53、Ki-67，將相應病例的組織蠟塊挑出，與SIRT1同時行免疫組化檢測。所用試劑：兔抗人SIRT1單克隆抗體（克隆號[E104]ab32441）購于美國Abcam公司，工作濃度均為1：100；p53、Ki-67為即用型單克隆抗體，二抗為快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，均購自福州邁新公司，免疫組化檢測試劑盒、濃縮型DAB試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司。參照試劑盒說明操作，以PBS代替一抗做陰性對照，已知陽性切片做陽性對照，光鏡下觀察染色結果，所有切片染色結果均由兩名資深病理醫師復審，以提高結果的可靠性。

1.3 結果判定：SIRT1蛋白主要定位于細胞核中，P53蛋白定位于細胞核，無背景著色情況下以胞核出現黃色或棕色顆粒者為陽性染色；每例均隨機觀察10個高倍視野，用半定量積分法判斷結果：①黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②計數10個高倍視野，陽性細胞在同類細胞中所占百分率<25%為0分，26%-50%為1分，51%-75%為2分，>75%為3分；③按上述兩項指標的分數乘積高低分為：0分為陰性（-），1-3分為弱陽性（+），4-6分為中度陽性（++），7-9分為強陽性（+++）。Ki-67結果判定標準：記數陽性腫瘤細胞數所占的比例，以5%為單位進行半定量評估，≤5%定義為陰性表達，>5%定義為陽性表達。

1.4 統計學分析

應用SPSS 17.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，相關性采用Spearman等級相關分析，以α=0.05作為檢驗標準，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SIRT1在CRC和正常結直腸黏膜組織中的表達

SIRT1陽性著色定位于細胞核，呈黃色或棕黃色顆粒者為陽性著色（圖1），94例結直腸癌中SIRT1陽性表達率為81.7%（49/60），30例正常結直腸粘膜中SIRT1陽性表達率分別為36.7%（11/30），兩組比較差異有統計學意義（χ2=18.225，P=0.000）。

圖1a SIRT1在正常結直腸黏膜組中呈陰性表達 SP法

圖1b SIRT1在結直腸癌組織中呈陽性表達 SP法

2.2 SIRT1表達與CRC臨床病理特征的關系

CRC中SIRT1的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織學分化、遠處轉移及癌胚抗原（CEA）等無關，差異均無統計學意義（P>0.05）；SIRT1的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期呈顯著正相關，晚期、浸潤較深、有淋巴結轉移的陽性率高于早期、浸潤較淺、無淋巴結轉移的陽性率，差異有統計學意義（P<0.05，表1）。

2.3 CRC中SIRT1、p53、Ki-67的表達及相關關系

SIRT1陽性表達49例中，p53陽性表達率為69.4%（34/49），SIRT1陰性表達11例中，p53陽性表達率為27.3%（3/11），二者差異有統計學意義（χ2=5.761，P=0.016）；SIRT1陽性表達病例49中，Ki-67陽性表達率為83.6%（41/49），SIRT1陰性表達病例11例中，Ki-67陽性表達45.5%（5/11），二者差異有統計學意義（χ2=5.354，P=0.021，表2），SIRT1表達與p53、Ki-67表達呈正相關。

3 討論

SIRT1廣泛表達于胎兒及成人組織中，作為sirtuin家族中研究最為廣泛的成員之一，已被證實與多種生理學事件相關，其生理功能均涉及DNA損傷修復、基因轉錄沉默、細胞生長周期調控、能量代謝、血管生成、神經保護等，通過限制能量攝入過程激活SIRT1，可延長細胞壽命，故有“長壽基因”之稱[7]。目前SIRT1在腫瘤細胞中的作用尚未得到統一，現有累積的證據支持SIRT1在腫瘤的形成中具有雙重作用，一方面由于SIRT1具有抗炎、基因組穩定性和促進癌細胞死亡的作用，SIRT1基因缺失將導致遺傳不穩定性及致癌作用，另一方面，SIRT1可通過刺激腫瘤信號傳導通路，創建腫瘤微環境利于癌細胞的生長和存活，且具有鈍化抑癌基因和DNA損傷修復蛋白的作用，被認為是腫瘤促進因子。相關研究證實SIRT1在不同組織中有不同的致瘤作用，在皮膚癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌中高表達，而在膀胱癌中表達降低，SIRT1在腫瘤中的這種雙重作用可能與亞細胞定位狀態密切相關[8]，核漿中具有不同的特異性底物，且由于其調節底物眾多，近年來備受關注。本實驗研究發現SIRT1陽性表達定位于細胞核，未發現細胞質中有陽性表達，SIRT1在CRC組織中較正常組織中表達增高，且SIRT1的表達與CRC的腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期呈正相關，SIRT1在有淋巴結轉移組中的陽性表達率高于無淋巴結轉移組，差異具有統計學意義，說明SIRT1的高表達可能與腫瘤的侵襲、預后有關，SIRT1可能通過某種機制促進腫瘤淋巴結轉移，并可能成為判斷結直腸癌惡性程度及預后的指標。研究發現[9]SIRT1通過去乙酰化核因子NF-κB的RelA/P65亞基降低其轉錄活性而負性調節基質金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9，MMP9）而影響癌細胞的浸潤和轉移。Lovaas等[3]研究證實SIRT1在晚期前列腺癌組織中高表達，并通過去乙酰化基質金屬蛋白酶2（Matrix metalloproteinase-2，MMP2）的表達來促進前列腺腫瘤細胞的侵襲。

p53是最早發現的SIRT1的生理底物[2]，SIRT1可去乙酰化及鈍化p53蛋白而發揮抗凋亡效應。p53在體內有野生型和突變型兩種，野生型p53具有抑癌作用，突變型p53由于喪失其抑癌功能使細胞無限增殖而誘發腫瘤，由于野生型p53半衰期短，利用免疫組化方法只能檢測到突變型p53的表達。研究顯示[10]SIRT1 和 p53 之間的關系較為復雜，在野生型p53表達的細胞中SIRT1過表達具有致癌作用，在突變型p53表達的細胞作用卻相反。在本研究中發現，SIRT1表達與p53表達呈顯著正相關，提示這兩個因子在結直腸癌的發展進程中可能起到了正調節協同作用，腫瘤中SIRT1的表達和p53突變有關，但是這種關系尚需進一步研究證實，因為p53突變可能會改變SIRT1對p53活性的生物學影響。SIRT1介導的p53去乙酰化在轉錄和翻譯過程中存在多個反饋條路，包括與抑癌基因HIC1、DBC1形成的HIC1-SIRT1-p53通路、DBC1-SIRT1-p53通路，還可與miRNA-34a、Myc以及Necdin形成反饋條路，影響腫瘤的發生發展。SIRT1的抑制劑尼克酰胺[11]可以抑制慢性淋巴細胞白血病中高表達的SIRT1的活性，如果淋巴細胞表達野生型p53，那么尼克酰胺可以抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡。由于SIRT1通過p53途徑調節的底物因子眾多，其機制相當復雜，p53與SIRT1之間的關系還需搜集更多的臨床數據進行深入研究。

Ki-67基因定位于10號染色體，是一種DNA結合蛋白，表達于除G0外的整個細胞周期中，是反映組織細胞增殖活性的重要指標，其陽性著色的細胞百分比可用來客觀評價細胞的增殖狀態。研究表明，細胞增殖標志物Ki-67的表達與乳腺癌的臨床病理特征及預后相關聯，并且在評估新輔助化療及內分泌治療的療效方面具有重要的預測價值。Ki-67高表達可作為乳腺癌的不良預后因素，其與腫瘤的發展、轉移和預后高度相關。本實驗中結直腸癌組織中Ki-67在SIRT1陽性組的表達水平明顯高于SIRT1陰性組，這與Feng等[12]研究結果一致，提示SIRT1陽性病例中更多的腫瘤細胞處于增殖活躍狀態，SIRT1陽性表達的腫瘤患者預后教陰性表達者差。

綜上所述，SIRT1可能參與了CRC的發生、發展，聯合檢測SIRT1、p53、Ki-67比單獨檢測SIRT1的表達可能具有更重要的臨床意義，可作為評估CRC惡性程度及臨床預后的生物學標記物。CRC的治療目前以手術治療為主，輔以化療治療，而耐藥的形成往往使腫瘤細胞免受化療藥物而影響化療療效及預后。Chu等[13]研究證明，SIRT1參與腫瘤細胞的放化療耐受，與腫瘤耐藥性關系密切，用SIRT1去乙酰化酶抑制劑克服腫瘤細胞的多藥耐藥性，有可能具有應用前景。Chen[14]等研究表明抑制SIRT1不僅幫助消除慢性髓細胞白血病干細胞，也能阻止耐藥性的產生，對治療其他惡性腫瘤也有益，這無疑對術后輔助化療及晚期失去手術機會依賴化療的患者提供了臨床指導意義。SIRT1作為一種新的治療靶點，值得進一步研究。

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通訊作者簡介：

郭淑芹，女，河北保定人，教授，碩士生導師，研究方向：內分泌腫瘤醫學。