少突膠質前體細胞缺血缺氧損傷模型的建立

吳錫艷 何揚濤

【摘 要】 目的：建立少突膠質前體細胞缺血缺氧腦白質損傷模型。 方法：將大鼠少突膠質前體細胞分為正常對照組和缺氧缺糖組，正常對照組細胞用DMEM-F12培養基培養，不做缺氧缺糖處理，缺氧缺糖組細胞用無糖DMEM和Na2S2O4處理，Na2S2O4終濃度為10mmol/L。取處理后10min、30min、60min和90min為觀察點，進行形態學觀察和MTT測定。結果：與對照組相比，缺氧缺糖組OPCs形態隨缺氧缺糖時間的延長而發生明顯改變，細胞存活率降低。討論：聯合應用無糖培養基和連二亞硫酸鈉可以在常氧培養條件下建立少突膠質前體細胞缺氧缺糖模型。

【關鍵詞】 少突膠質前體細胞 缺血缺氧模型 建立

【中圖分類號】 R722.6 【文獻標識碼】 A 【文章編號】 1671-8801（2014）03-0388-01

目前，腦白質損傷已成為早產兒腦損傷的重要形式。研究表明，缺氧缺血（HI）、感染和免疫損傷等多種因素均可以導致新生兒腦白質損傷的發生[1]。尤其是缺氧缺血，這與腦白質的主要細胞成分-少突膠質細胞有關[3]。不同發育階段的少突膠質細胞對缺氧缺血的耐受性不同，晚期少突膠質祖細胞和未成熟少突膠質細胞最為易損，成熟少突膠質細胞最為耐受。由于神經膠質中少突膠質細胞發育最晚，在胎齡24周左右才逐漸由其前體細胞向成熟少突膠質細胞轉化，因此，早產兒的胎齡越小，其腦白質中少突膠質的前體細胞含量越多，就越容易發生腦白質損傷。而目前對新生兒缺血缺氧性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的治療僅局限于支持療法，尚無促進神經再生的手段[7]。探討缺血缺氧腦白質損傷發生的特點和機制己成為迫切的需要，尋求簡單可行的方法建立缺血缺氧腦白質損傷模型，則有助于深入了解缺血缺氧引起少突膠質前體細胞損傷的機制，同時也能夠為探尋有效的干預、治療措施提供平臺。

1 OPCs的培養

按照本實驗室牛建欽的“少突膠質前體細胞的分離純化方法”[12]培養OPCs。

2 少突膠質前體細胞缺氧缺糖離體模型的建立

取純化培養2天，經鑒定為PDGFαR陽性的大鼠少突膠質前體細胞制作缺氧缺糖模型。將大鼠少突膠質前體細胞分為正常對照組和缺氧缺糖組，正常對照組細胞用DMEM-F12培養基培養，不做缺氧缺糖處理，缺氧缺糖組細胞用無糖DMEM和Na2S2O4處理，Na2S2O4終濃度為10mmol/L。取處理后10min、30min、60min和90min為觀察點。進行形態學觀察和MTT的測定。

3 結果

3.1 倒置相差顯微鏡下觀察少突膠質前體細胞的形態變化

缺氧缺糖組OPCs形態隨缺氧缺糖時間的延長而發生明顯改變。缺氧缺糖10分鐘時，細胞仍貼壁生長，細胞折光性無明顯改變，部分突起出現輕度腫脹，呈節段樣或“串珠樣”改變，胞體腫脹尚不明顯。缺氧缺糖30分鐘，少量細胞不能貼壁而開始漂浮，貼壁細胞折光性減弱，胞體輕度腫脹，細胞突起節段樣或“串珠樣”改變更加明顯，部分突起回縮。缺氧缺糖60分鐘，漂浮細胞增加，貼壁細胞明顯腫脹、胞體混濁，細胞突起多數節段性腫脹明顯，可見較多突起斷裂。缺氧缺糖90分鐘，大部分細胞漂浮，剩余細胞多數胞體極度腫脹，胞質內可見大小不等的空泡，細胞核不清，突起斷裂，可見較多細胞已經崩解。

3.2 MTT法（四哇氮鹽比色實驗）測定少突膠質前體細胞存活率

結果顯示，在缺氧缺糖早期，缺氧缺糖組細胞存活率較正常對照組已有降低，但尚無統計學意義（P>0.05）；隨著缺氧缺糖時間的延長，細胞存活率逐漸降低，60min時，細胞存活率已降到接近50%，到90min時，已剩下不到一半細胞存活，與對照組相比，差異均有顯著性（P<0.05）（表1）

4 討論

本實驗中，在缺氧缺糖后開始后，細胞很快就出現形態學上面的改變，隨著缺氧缺糖時間的延長，細胞開始出現水腫、細胞活力明顯減退，細胞突起水腫、斷裂，直至最后多數細胞漂浮，細胞極度腫脹乃至崩解。MTT法檢測也提示細胞存活率隨著時間的延長逐漸降低，至60分鐘時已降至正常的一半左右，90分鐘時則已降至正常的一半以下，說明連二亞硫酸鈉和無糖培養基的聯合應用使少突膠質細胞在較短的時間內即出現了缺氧性損傷和丟失，可以模擬嚴重腦白質損傷的細胞改變情形。但由于缺氧缺糖至90分鐘時，大部分細胞己經死亡和丟失，不利于后續的實驗研究，故選用存活細胞大約有50%的60分鐘來作為終止缺氧缺糖的時間。

參考文獻

[1]Michael V， Johnston， William H， et al. Neurobiology of Hypoxic-Ischemic Injury in the Developing Brain. Pediatric Research， 2001， 49（6）： 735-741.

[2]Volpe JJ. Hypoxic-ischemic encephalopathy. Neurology of the Newborn， 4th edi. Philadelphia： W.B. Saunders company， 2001， 217.

[3]Snyder EY， Wolfe JH. Central nervouse system cell tansplantation： a novel therapy for storage diseases？ Curr Opin Neurol， 1996， 9（2）： 126-136.

[4]牛建欽，肖嵐.P.少突膠質前體細胞的分離純化方法.2011，7.