紅松種鱗多酚的二次純化工藝及其抗氧化性的研究

符群 徐明慧 王振宇

摘要

[目的]為了驗證紅松種鱗多酚二次純化及抗氧化特性。[方法]采用聚酰胺層析柱法對經AB8樹脂純化后的紅松種鱗多酚純化液進行二次純化，并且測定其DPPH自由基清除率、總還原能力。[結果]通過正交試驗分析，得到聚酰胺二次純化的最優條件為：聚酰胺樹脂30～60目、上樣pH 5、吸附時間1 h、洗脫液為乙醇、上樣量2 BV、洗脫濃度70%、洗脫pH 7。在此工藝下，多酚的純度可達62%±2%。二次純化后的多酚清除DPPH自由基的IC50值為10.94 μg/ml，總還原能力與VC的相似且略高于一次純化的多酚液。[結論]紅松種鱗二次純化多酚純度約為一次純化多酚的2倍，且具有抗氧化特性。

關鍵詞 紅松；多酚；二次純化；抗氧化

中圖分類號 S791.247 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）26-08879-05

Korean Pine Species of Scale Secondary Purification Process of Polyphenols and Oxidation Resistance

FU Qun， WANG Zhenyu et al

（School of Forestry， Northeast Forestry University， Herbin， Heilongjiang 150040； School of Food Science and Engineering， Herbin Institute of Technology， Herbin， Heilongjiang 150001）

Abstract [Objective]The research aimed to test and verify secondary purification and antioxidant properties of Korean pine scale polyphenols. [Method]By polyamide column chromatography method for AB8 resin purification of Korean pine scale polyphenols， liquid after secondary purification was purified， and DPPH free radical clearance rate and the total reducing power were determined. [Result] Polyamide was obtained by the orthogonal experiment analysis. The optimal conditions for secondary purification was as follows： 30 to 60 mesh polyamide resin， sample pH 5， adsorption time1 h， eluent for ethanol 2 BV on sample amount， elution concentration 70%， elution pH 7. In this process， the purity of polyphenols was up to 62%±2%. IC50 value of secondary purified polyphenols removal DPPH free radical was 10.94 μg/ml， total reducing power was similar to VC and slightly higher than the fluid of a purified polyphenols. [Conclusion] Korean pine species of scale secondary purified polyphenols purity was about 2 times a purified polyphenols， and had antioxidant properties.

Key words Korean pine；Polyphenols；Secondary purification；Antioxidant activity

隨著社會的持續發展，人們生活節奏的加快，環境污染日益嚴重，人們的患病幾率大幅度增加。鄭晶泉^[1]在抗氧化劑抗氧化試驗研究進展中提到，大多數疾病的發生均與自由基有關，如衰老、心腦血管病、類風濕、癌癥、帕金森癥、關節炎等。多數研究表明，抗氧化物質可以有效地抵消自由基對人體造成的損傷^[2]。因此，人們對抗氧化劑的關注度不斷加強。目前合成的食品抗氧化劑已被廣泛應用于食品的生產、保藏，同時人們對這類合成抗氧化劑毒副作用堪憂^[3]。因此，從天然食材中尋找安全的天然抗氧化物質成為了研究熱點。天然抗氧化劑主要來源于植物多酚。而Petkovsek等^[4]研究表明，多酚的抗氧化特性與其含量、種類有關。

聚酰胺是一類通過聚酰胺基聚合而成的高分子化合物^[5]。其物理性質較穩定，操作方便，可循環利用，成本較低，污染較小，因此在分離純化多酚類、黃酮類、汞、醌等物質上被廣泛運用。楊武英等^[6]通過聚酰胺精純得到純度為81.34%的青錢柳黃酮，純度比粗提品提高6.14倍，且黃酮含量高，具有安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅松種鱗采自長白山；聚酰胺，購自浙江省臺州市路橋四甲生化塑料；DPPH（ALDrich公司）；無水乙醇，購自天津市東麗區天大化學試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1

紅松種鱗多酚一次純化液的制備。稱取一定量的紅松種鱗粉末，在40 ℃條件下按照料液比1∶30以濃度50%無水乙醇為浸提溶劑進行水浴提取。經旋轉蒸發除去乙醇的多酚粗提物，采用AB8大孔樹脂進行純化（多酚純度達到42%）。純化液經旋轉蒸發去除無水乙醇后，4 ℃冷藏保存，備用。

1.2.2

標準曲線。采用FolinCiocalteus法^[7]，測定總多酚含量。以沒食子酸為標準，對照計算樣品中多酚含量，標準曲線方程為y=0.011 6x+0.041，R2=0.999 5，其中y表示吸光值，x表示沒食子酸含量（μg/ml）。

1.2.3

紅松種鱗多酚二次純化。

1.2.3.1

二次純化靜態試驗。

（1）不同型號聚酰胺的選擇。分別稱取經預處理不同型號的聚酰胺各1 g于干凈的250 ml錐形瓶中，向錐形瓶中加入 1 mg/ml樣液20 ml，在120 r/min 20 ℃恒溫振蕩器中振蕩吸附24 h，測定溶液中剩余總酚的濃度，計算被聚酰胺吸附的多酚吸附量；然后，將充分吸附后的聚酰胺浸泡于80 ml濃度85%乙醇溶液中，于120 r/min 20 ℃恒溫振蕩器中振蕩洗脫24 h，測定乙醇溶液中多酚濃度，計算乙醇洗脫率；將洗脫液烘干后復溶，測定其純度。

（2）吸附時間。分別稱取30～60目聚酰胺1 g于干凈的250 ml錐形瓶中，向錐形瓶中加入 1 mg/ml樣液20 ml，在120 r/min 20 ℃恒溫振蕩器中振蕩吸附。每隔30 min測定溶液中剩余總酚濃度，計算被聚酰胺吸附的多酚的吸附量。以時間為橫軸，以聚酰胺吸附量為縱軸，繪制聚酰胺吸附多酚的靜態吸附曲線。

（3）上樣pH。稱取30～60目聚酰胺1 g于250 ml錐形瓶中，分別加入1 mg/ml pH為3、4、5、6、7樣液20 ml，于120 r/min 20 ℃恒溫振蕩器中振蕩吸附24 h，測定溶液中剩余總酚的濃度，計算聚酰胺的吸附量。以pH為橫軸，以聚酰胺吸附量為縱軸，繪制聚酰胺對不同pH的紅松多酚靜態吸附曲線。

N=（C₀-C₁）×V/M

式中，N為吸附量（mg/g）；

C₁為吸附后多酚濃度（mg/ml）；

C₀為吸附前多酚濃度（mg/ml）；

V為供試液體積（ml）；

M為聚酰胺質量（g）。

（4）洗脫液的選擇。分別稱取30～60目聚酰胺1 g于干凈的250 ml錐形瓶中，加入1 mg/ml樣液20 ml，于120 r/min 20 ℃恒溫振蕩器中振蕩吸附24 h，測定溶液中剩余總酚的濃度，用蒸餾水沖洗過濾后，將充分吸附多酚樣液的聚酰胺樹脂分別浸泡于不同濃度梯度的乙醇、甲醇、丙酮中，于120 r/min 20 ℃恒溫振蕩器振蕩24 h，測定洗脫溶液中多酚的濃度，計算洗脫率；將洗脫液烘干后復溶，測定其純度。

1.2.3.2

二次純化動態試驗。

（1）洗脫液用量。將濃度為1 mg/ml的一次純化液2 BV，以1 ml/min流速上樣，吸附1 h后，用蒸餾水除雜，分別用1、2、3、4、5 BV（聚酰胺填柱量）pH 7濃度70%乙醇溶液以（0.4±0.2）ml/min的流速洗脫，收集洗脫液，計算在不同體積乙醇洗脫下多酚洗脫率、純度，并且繪制洗脫曲線、純度曲線。

D=M₁/（M₂-M₃）×100%

式中，D為洗脫率（%）；

M₁為解吸液中多酚含量（mg）；

M₂為吸附前樣品中多酚含量（mg）；

M₃為吸附后樣品中多酚含量（mg）。

P=（M₁/M₂）×100%

式中，P為紅松多酚純度（%）；

M₁為洗脫液中多酚含量（mg）；

M₂為洗脫物干重（mg）。

（2）上樣量。分別吸取濃度為1 mg/ml一次純化液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 BV（聚酰胺填料量）以（1.0±0.2）ml/min進行吸附。檢測漏出液中多酚含量，漏出液多酚濃度達上柱濃度的10%（達到泄露點）停止上柱，考察上柱量對聚酰胺吸附一次純化后紅松多酚的影響，繪制動態吸附曲線。

（3）洗脫濃度。將濃度為1 mg/ml的一次純化液2 BV以1 ml/min進行吸附，吸附1 h后，用蒸餾除雜，分別用濃度40%、50%、60%、70%、80%pH為7的乙醇溶液以（0.4±0.2） ml/min的流速洗脫，收集洗脫液，計算在不同濃度乙醇洗脫下的多酚洗脫率、純度，并且繪制洗脫曲線、純度曲線。

（4）洗脫液pH。將濃度為1 mg/ml的一次純化液2 BV以1 ml/min上樣，吸附1 h后，用蒸餾水除質，分別用pH為6、7、8、9、10 的濃度70%乙醇溶液以（0.4±0.2） ml/min的流速洗脫，收集洗脫液，計算在不同pH乙醇洗脫下多酚洗脫率、純度，并且繪制洗脫曲線、純度曲線。

1.2.3.3

二次純化最優條件的確定。通過以上的靜態、動態的單因素試驗，確定紅松多酚二次純化的最優吸附時間、上樣pH、洗脫液的用量、上樣量、洗脫液濃度、洗脫液pH，以此為基礎，選取上樣量、洗脫液濃度及洗脫液pH 3個因素，通過L₉（34）正交試驗設計優化紅松多酚二次純化工藝條件。

1.2.4

紅松種鱗多酚抗氧化研究。

1.2.4.1

清除DPPH·試驗。以VC作為陽性對照，1 ml蒸餾水與3 ml無水乙醇混合液為空白對照。制備 0.10 mmol/L DPPH·無水乙醇溶液，取3 ml DPPH·溶液，加入1 ml不同濃度多酚樣液，室溫下反應30 min后在519 nm處測吸光度，讀數為A₁；取3 ml無水乙醇溶液，加入1 ml多酚樣液，室溫下在519 nm處測吸光值，讀數為A₂；取3.00 ml DPPH·溶液，加入1 ml無水乙醇，在519 nm處測吸光度，讀數為A₀。

DPPH·清除率=1-

1.2.4.2

總還原力的測定。以VC作為陽性對照，取不同濃度樣品的溶液1 ml，立即加入1 ml 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）和1 ml濃度1%鐵氰化鉀。將混合物放置在50 ℃的水浴鍋中保溫20 min，添加1 ml濃度10%三氯乙酸，將混合物在室溫下3 500 r/min離心10 min，吸取1 ml上清液，加入6 ml蒸餾水和0.5 ml濃度0.1%三氯化鐵，混勻后反應10 min。用分光光度計在700 nm下測得反應物的吸光值，空白以蒸餾水代替樣液。吸光值和還原能力呈正比。以吸光值為結果，比較還原能力。

2 結果與分析

2.1 紅松種鱗多酚二次純化工藝條件的優化

2.1.1

紅松種鱗多酚二次純化靜態試驗。

2.1.1.1

不同型號聚酰胺樹脂的篩選。由表1可知，隨著聚酰胺目數的增大，吸附量增大，而洗脫率、純度則反之。這是由于隨著聚酰胺目數的增大，其與料液接觸的面積也相應增加，因此其吸附量呈上升趨勢；但是，由于目數越大，單個聚酰胺分子對多酚的吸附就越緊密，導致洗脫較困難，且目數較大的聚酰胺中含有較細的聚酰胺粉末，易隨洗脫液一同流出，影響多酚的純度；目數越大的聚酰胺樹脂越難進行預處理。因此，綜合考慮，應選30～60目聚酰胺作為該次試驗的柱層析樹脂。

2.1.1.2

吸附時間對多酚吸附量的影響。 通過聚酰胺靜態吸附試驗，每半個小時測定一次多酚含量，得出吸附時間與多酚吸附量的關系。由圖1可知，隨著時間的增加，聚酰胺對一次純化液的吸附量也增加，且吸附速率較快，當吸附時間為1.5 h時達到吸附飽和。考慮到縮短吸附時間有利于縮短工業生產周期、提高生產效率，且1.0、1.5 h的吸附量相差不大，在進行柱層析時選擇1.0 h為最佳吸附時間。該結果與吳新榮等^[8]在聚酰胺顆粒分離純化土茯苓總黃酮研究中對靜態吸附時間的試驗結果相符合，其試驗的最佳吸附時間為1～2 h。

化學合成藥的分離純化成本一般是合成反應成本費用的1～2倍，且不同的分離提取方法對多酚的有效成分的影響不同。由此可見，分離提取是產品生產合格的重要保障。因此，研究和改善分離提取方法，對于產品質量的提高及發揮具有相當重要的作用。

該研究以AB8大孔吸附樹脂將紅松種鱗多酚提取物進行一次純化后，采用聚酰胺以層析柱法，對紅松種鱗多酚的一次純化物進行二次純化，分別考察聚酰胺樹脂型號、上樣pH、吸附時間、洗脫液、上樣量、洗脫濃度、洗脫pH對純化效果的影響。通過正交試驗優化二次純化的工藝條件，得到的最佳工藝條件為：聚酰胺樹脂型號為30～60目、上樣pH 5、吸附時間1 h、洗脫液為乙醇、上樣量2 BV、解吸濃度70%、解吸pH 7。試驗結果表明，聚酰胺柱層析對多酚的二次純化具有顯著的效果，可使純度由粗提時的12%±3%提高到62%±2%，為多酚單體的獲得奠定基礎，同時為抗氧化產品的開發提供較優原料。

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