RNAi技術介導舞毒蛾熱激蛋白Hsp40基因功能分析

王志英 問榮榮

摘要 [目的]測定Hsp40基因沉默對舞毒蛾生長發育及Hsp40基因表達量的影響。[方法]體外合成雙鏈RNA（dsRNA），并將dsRNA通過微注射入舞毒蛾3齡幼蟲體內，測定Hsp40基因沉默對舞毒蛾生長發育及Hsp40基因表達量的影響。[結果]分別注射ddH₂O、dsRNAGFP和dsRNAHsp40 后8 d，dsRNAGFP處理組舞毒蛾幼蟲相對取食量顯著高于ddH₂O和dsRNAHsp40處理組（P<0.05）；但3種處理對舞毒蛾幼蟲的相對生長率、食物利用率、食物轉化率、近似消化率方面均無顯著性差異。注射后4 d，ddH₂O處理組的舞毒蛾幼蟲體重累計增長率最大，其次是dsRNAHsp40處理組，dsRNAGFP處理組的體重累計增長率最小，這與4 d的幼蟲鮮重一致；其余時間點，dsRNAHsp40處理組的體重累計增長率均大于ddH₂O和dsRNAGFP處理組。將1 μl（1 μg/μl）的dsRNA注射入舞毒蛾幼蟲體內，6～48 h Hsp40基因表達量顯著下降，96 h基因表達量上調。[結論] 該研究為進一步利用沉默舞毒蛾Hsp40基因在害蟲防治中的應用提供理論依據。

關鍵詞 舞毒蛾；Hsp40；RNA干擾；基因沉默

中圖分類號 S188 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）26-08890-04

Functional Analysis of Hsp40 Gene in Lymantria dispar Mediated RNAi Technology

WANG Zhi-ying et al （College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to measure the effects of Hsp40 gene silencing on growth and Hsp40 gene expression of L.dispar larvae.[Method] The 1 μg/μl of double-stranded RNA （dsRNA） in vitro synthesized，was microinjected into 3rd instar Lymantria dispar larvae. The effects of Hsp40 gene silencing on growth and Hsp40 gene expression of L. dispar larvae were measured. [Result]The results showed the relative consumption rate （RCR） of L. dispar larvae microinjected by dsRNAGFP was higher than those microinjected by ddH₂O and dsRNAHsp40 at 8 d time point. However， relative growth ratio （RGR）， efficiency of conversion of ingested food （ECI）， approximate digestibility （AD）， efficiency of conversion of digested food （ECD） of L. dispar larvae among three treatments were no significant differences. After 4 d of microinjection， the weight cumulative growth rates of L. dispar larvae were decreasing order of ddH₂O， dsRNAHsp40 and dsRNAGFP， which were consistent with the larvae weight. At the rest of time points， weight cumulative growth rate of dsRNAHsp40 treatment group were greater than other treatment groups. After microinjection 1 μg/μl of dsRNA into the L. dispar larvae ranged from 6 h to 48 h， Hsp40 gene expressions were significantly decreased，while those increased at 96 h. [Conclusion]These results provided a theoretical basis for further silencing Hsp40 gene of L. dispar into pest control.

Key words Lymantria dispar；Hsp40；RNAi；Gene silencing

NAPOLI等^[1]將外源基因引入矮牽牛（Petunia hyhrida Vilm）后發現內源同源基因出現沉默，將此現象稱為共抑制。GUO等^[2]用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發現，反義和正義RNA都阻斷了基因的表達。1998年，FIRE等^[3]在線蟲 （Caenorhabditis elegans）試驗中發現在體外轉錄正義RNA時生成的雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）導致基因表達的阻斷。將由dsRNA引發生物體同源序列mRNA降解而最終導致特異性基因轉錄后沉默的效應稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。這一現象主要是通過dsRNA被一種稱為Dicer的核酸酶切成21～25 nt的干擾性小RNA片段（siRNA），由siRNA介導識別并靶向切割同源性靶mRNA分子而實現基因沉默^[4-7]。現已在真菌、植物、線蟲、昆蟲、哺乳動物等許多真核生物體內都發現了這種現象。由于RNAi誘導基因沉默的特異性^[8]和高效性，特別是在非模式生物中操作的簡便性，被廣泛應用于多種生物的基因功能研究和有害生物控制研究^[9-10]，并實現了對鱗翅目昆蟲煙草天蛾（Manduca sexta）^[11-12]、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）^[13]和棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）^[14]等蟲體內部分基因功能的研究。

熱激蛋白（Heat Stress Proteins，Hsp）具有分子伴侶功能，主要參與生物體內新生肽的運輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復性和降解，在細胞生命活動中起著重要作用^[15]。Hsp40蛋白是一類重要的分子伴侶，具有重要的生理功能。研究表明Hsp40蛋白在生物體正常及熱激^[16]、鹽^[17]、重金屬^[18]、毒物代謝等脅迫下參與蛋白質的折疊、轉運、分泌和目標蛋白的降解等作用。Hsp40能夠通過調節Hsp40/Hsp70的ATPase活性，使得Hsp70結合的底物多肽發生折疊，促進部分變性的蛋白復性（重新折疊）來保護脅迫損害的細胞并使其恢復正常功能^[19-20]。Hsp40參與維持蛋白質結構的穩定和變性蛋白的復性作用，是一種與細胞多種生命活動密切相關的重要蛋白質^[21]。舞毒蛾（Lymantria dispar）是一種世界性的、周期性發生的為害嚴重的森林食葉害蟲，分布廣，食性雜，國外報道可取食500多種植物，國內報道可為害楊、柳、落葉松、樟子松等多種植物，給林業生產造成較大的經濟損失。筆者從舞毒蛾轉錄本文庫中獲得Hsp40基因全長cDNA序列，測定了RNAi對舞毒蛾幼蟲營養利用及蟲體鮮重變化情況的影響，并進一步采用實時熒光定量PCR技術探討了體外合成dsRNA介導RNAi對Hsp40基因表達的影響，為RNAi技術在舞毒蛾防治中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

舞毒蛾初始卵塊和人工飼料購于中國林業科學研究院森環森保研究所，幼蟲于（25±1） ℃，光照14 L∶10 D，相對濕度75%的條件下人工飼養，取健康、大小一致舞毒蛾3齡幼蟲進行試驗。

1.2 dsRNA合成

采用RNeasy Mini動物組織總RNA提取試劑盒（Qiagen）提取舞毒蛾3齡幼蟲的總RNA，用DNase I處理后，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的純度和濃度。從舞毒蛾轉錄本文庫中獲得舞毒蛾Hsp40基因的cDNA全長序列和外源基因GFP的序列，分別設計引物（表1），每條特異性引物的5′端加20 bp的T7啟動子序列。以PrimeScriptTM RT 試劑盒（TaKaRa）合成的cDNA第1鏈為模板進行RT-PCR，反應條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環，72 ℃ 7 min，擴增產物經電泳檢測確認并純化后作為合成dsRNA的模板。參照MEGAscript RNAi試劑盒（Ambion）進行dsRNA的合成，于-80 ℃保存備用。

1.3 舞毒蛾營養利用與幼蟲鮮重測定

將舞毒蛾人工飼料稱其鮮重后放入培養皿內，分別接入饑餓10 h后體重大小相近的蟲體內，并利用微量進樣器（HAMILTON#489323）從腹部倒數第2節注入1 μl（1 μg/μl）的ddH₂O、dsRNAGFP和dsRNAHsp40的舞毒蛾3齡幼蟲，每組處理20頭幼蟲，重復3次^[22]。正常飼喂8 d，每天按時稱量幼蟲蟲體鮮重。待正常取食8 d后將舞毒蛾幼蟲、取食后的飼料及糞便分別移至50 ℃烘箱內烘4 h后，再升溫至120 ℃烘至恒重，稱干重，另取剛蛻皮的30頭3齡幼蟲饑餓10 h后稱重，并將新鮮人工飼料稱其鮮重，然后分別在上述條件下烘干至恒重稱取干重，計算幼蟲和人工飼料干濕比，以推測幼蟲和飼料干重。參照WALDBAUER^[23]方法計算各營養指標：相對生長率（RGR）=（D-C）/[（C+D）/2]×100%；相對取食量（RCR）=（A-B）/[（C+D）/2]；食物利用率（ECI）=（D-C）/（A-B）×100%；食物轉化率（ECD）=（D-C）/（A-B-E）×100%；近似消化率（AD） =（A-B-E）/（A-B）×100%。式中，A為試驗前飼料干重；B為試驗后飼料干重；C為試驗前幼蟲干重；D為試驗后幼蟲干重；E為幼蟲糞便干重。

體重累計增長率（%）=（注射后的體重-注射前的體重）/注射前的體重×100

1.4 實時熒光定量RT-PCR

將1 μl（1 μg/μl）GFP和Hsp40的基因dsRNA注射入舞毒蛾3齡幼蟲體內，以ddH₂O為對照，分別于6、24、48、96 h選取活潑的3齡幼蟲提取總RNA，經DNase I（Promega）消化DNA，采用PrimeScriptTM RT 試劑盒（TaKaRa）合成cDNA，將合成cDNA稀釋成100 μl，用作實時熒光定量PCR模板。實時熒光定量PCR使用試劑盒SYBR Green Real-time PCR Master mix（Toyobo）。內參基因為Actin、EF1α和TUB，引物序列見表1。實時熒光定量PCR反應體系為：10 μl 2×SYBR premix ExTaq酶、正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μl、2 μl cDNA模板，加去離子水補足20 μl；反應條件為：94 ℃ 30 s，94 ℃ 12 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，4個循環，最后81 ℃ 1s讀板。每處理重復3次，用2-△△Ct方法進行基因的表達量分析^[24]。

1.5 數據統計分析

采用統計軟件SPSS17.0（SPSS Inc.，USA）單因素方差分析（One-way ANOVA，Duncan）進行差異顯著性分析。采用EXCEL2007軟件進行數據統計和繪圖。

2 結果與分析

2.1 dsRNA質量檢測

提取的舞毒蛾幼蟲總RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計測得RNA的A260/A280=1.96，RNA質量合格。合成相應的dsRNA，用2%瓊脂糖凝膠檢測dsRNA的大小（圖1），得到清晰的目的條帶，經分光光度計測定，Hsp40基因dsRNA A260/A280=1.84，濃度為4.36 μg/μl，GFP基因dsRNA A260/A280=1.92，濃度為6.15 μg/μl。

通常昆蟲RNAi研究的理想結果是靶標基因的沉默和出現相應生物表型的變化，然而并不是所有的試驗都能出現可觀表型異常。ARAUJO等^[27]給長紅烈蝽（Rhodnius prolixus）喂食針對唾液腺NP2基因的dsRNA有效降低了靶標基因的表達水平，但未產生可見的表型。OHNISHI等^[28]研究RNAi對家蠶pgFAR、pgACBP和PBANR等信息素生物合成途徑中的相關基因產生抑制時，發現信息素的生物合成卻受到了抑制，對蛹的發育和成蟲羽化并未產生任何影響。該研究通過將體外合成的dsRNA注射入舞毒蛾3齡幼蟲體內有效降低了靶標基因的表達水平；在正常飼喂條件下，分別注射ddH₂O、dsRNAGFP和dsRNAHsp40后，這3種處理下舞毒蛾幼蟲的相對生長率、食物利用率、食物轉化率、近似消化率均無顯著性差異。舞毒蛾幼蟲的體重累計增長率顯示，注射后4 d，ddH₂O對照組的體重累計增長率最大，dsRNAGFP處理組的體重累計增長率最小，這與4 d的蟲體鮮重情況一致；在其余時間點，dsRNAHsp40處理組的體重累計增長率均大于ddH₂O和dsRNAGFP處理組。熱激蛋白在細胞內具有多種功能，包括新生蛋白的折疊、胞吞作用，多肽穿過細胞器質膜的轉運，調整對各種脅迫的反應及對預降解蛋白的靶標等^[29-31]，并能夠通過促進部分變性的蛋白復性（重新折疊）來保護脅迫損害的細胞并使其恢復正常功能^[19-21]。Hsp40基因沉默可能會降低DnaK/Hsp70蛋白的活性，進而無法及時促進變性蛋白的復性，當機體受到脅迫損害時細胞不能及時恢復其功能正常，降低害蟲應對外界脅迫時產生的蛋白修復能力，從而達到控制害蟲的目的。筆者將通過舞毒蛾熱激蛋白Hsp40基因沉默對殺蟲劑脅迫的響應進一步探尋害蟲控制。

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