大孔吸附樹(shù)脂純化丹酚酸B的工藝研究

張翠英 章洪 王階

摘要[目的]利用大孔吸附樹(shù)脂優(yōu)化丹參中高純度丹酚酸B的純化工藝。[方法]大孔吸附樹(shù)脂純化考察包括樹(shù)脂類(lèi)型的選擇、上樣量、除雜溶劑、洗脫溶劑等多方面因素。[結(jié)果]確定丹參中丹酚酸B的純化樹(shù)脂為大孔吸附樹(shù)脂HP300、上樣量為1∶2（丹參∶樹(shù)脂）、2 BV水除雜、3 BV的40%乙醇洗脫。收集40%乙醇洗脫部分回收溶劑噴霧干燥，丹酚酸B純化物中丹酚酸B的含量為73.6%、68.9%。[結(jié)論]大孔吸附樹(shù)脂優(yōu)化的純化條件為丹酚酸B進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞丹參；丹酚酸B；純化；大孔吸附樹(shù)脂

中圖分類(lèi)號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）23-07752-02

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金（81202932）；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2013ZX09301307）。

作者簡(jiǎn)介張翠英（1972- ），女，遼寧喀左人，副研究員，博士，從事中藥藥效成分的研究。*通訊作者，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，從事心血管臨床研究。

收稿日期20140707丹酚酸B是丹參（唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖）中含量最高的水溶性有效成分，大量的藥理研究表明丹酚酸B具有較強(qiáng)的抗氧化、保護(hù)心肌和缺血再灌注損傷等作用[1-3]，在心腦血管疾病方面具有明確穩(wěn)定的療效。該試驗(yàn)是在前期研究的基礎(chǔ)上[4]，篩選純化丹酚酸B的大孔吸附樹(shù)脂，優(yōu)選大孔吸附樹(shù)脂純化丹酚酸B的純化工藝條件，為相關(guān)丹酚酸B制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器Agilent 1200型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、DAD檢測(cè)器（安捷倫公司）；METTLER AB135S電子天平（瑞士）。HZS4水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子科技開(kāi)發(fā)有限公司），B600B型臺(tái)式低速離心機(jī)（北京白洋醫(yī)用離心機(jī)有限責(zé)任公司），超純水系統(tǒng)（Millipore，USA）。

1.2材料大孔吸附樹(shù)脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD400A、HPD450、HPD500、HPD600、HPD700、D101、AB-8、DM130購(gòu)自河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司。丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)11071331，上海同田生物技術(shù)有限公司），乙腈（色譜純，美國(guó)FISHER公司），冰醋酸（分析純，北京化工廠），乙醇（醫(yī)用乙醇）。丹參飲片購(gòu)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院藥房，標(biāo)示為北京豐泰金源藥業(yè)有限公司（批號(hào)12120602，產(chǎn)地山東），經(jīng)張翠英副研究員鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖加工成的飲片。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件。Agilent TCC18 BDS（250×4.6 mm， 5 μm）色譜柱。流動(dòng)相為乙腈 （A）1%醋酸（B），梯度洗脫分別為0～5 min、12%～20%A，5～10 min、20%～22%A；10～13 min、22%A，13～25 min、22%～30%A，25～35 min、30%～65%A，均為線性洗脫；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；柱溫35 ℃。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制。精密稱(chēng)取丹酚酸B對(duì)照品適量（5.74 mg）置10 ml棕色量瓶中，加75%甲醇配制成丹酚酸B對(duì)照品貯備溶液（0.574 mg/ml）。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)方程的建立。精密吸取貯備溶液適量分別配制成一系列濃度的對(duì)照品溶液（11.48、22.97、57.42、114.84、229.69、574.22 μg/ml），分別進(jìn)樣5 μl，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.3.4丹酚酸B的含量測(cè)定。精密吸取樣品液或洗脫液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)?jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算丹酚酸B的含量。

1.3.5樹(shù)脂的預(yù)處理。選擇處理好的大孔吸附樹(shù)脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD400A、HPD450、HPD500、HPD600、HPD700、D101、AB-8適量，按照大孔吸附樹(shù)脂的用前處理方法，用乙醇浸泡4 h以上，上柱用乙醇沖洗，沖洗至無(wú)白色混濁物，流出液與水以1∶1的比例混合后仍澄清，再用水洗至無(wú)醇味。

1.3.6靜態(tài)吸附篩選樹(shù)脂。分別稱(chēng)取5 g，置于錐形瓶中，分別加入已知丹酚酸B含量的丹參水提濃縮液100 ml，水浴恒溫（30 ℃）振搖（50轉(zhuǎn)/min）24 h；吸附后的溶液過(guò)濾，采用“1.3.1色譜條件”測(cè)定，計(jì)算每種樹(shù)脂的吸附量。同時(shí)將每種吸附丹參水提液的大孔吸附樹(shù)脂分別用不同比例的乙醇溶液（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇）依次洗脫，采用HPLC法測(cè)定洗脫液中丹酚酸B的含量。

1.3.7根據(jù)動(dòng)態(tài)吸附優(yōu)選樹(shù)脂。分別稱(chēng)取預(yù)處理好的大孔吸附樹(shù)脂HPD300和AB8適量，裝入玻璃層析柱（內(nèi)徑1.5 cm），精密吸取丹參水提濃縮液45 ml上樣，每5 ml流出液取樣一次，HPLC法測(cè)定丹酚酸B含量，根據(jù)流出液體積和丹酚酸B的滲出量繪制吸附曲線。

1.3.8根據(jù)洗脫情況優(yōu)選樹(shù)脂。分別用水、5%、10%、30%、40%、50%、70%乙醇進(jìn)行洗脫，根據(jù)丹酚酸B的含量?jī)?yōu)選除雜容劑和最佳洗脫溶劑。

1.3.9水提液上樣量的優(yōu)化。取大孔吸附樹(shù)脂HPD300各5 g裝入3根層析柱，精密吸取丹參不同體積的水提濃縮液上樣，先用2 BV水除雜，再分別用40%乙醇5 BV洗脫，每1 BV洗脫液收集一次，HPLC法測(cè)定洗脫液中丹酚酸B的含量，計(jì)算大孔吸附樹(shù)脂HPD300對(duì)丹酚酸B滲漏和洗脫情況，確定丹參藥材和樹(shù)脂的最佳比例。

1.3.10丹酚酸B純化物的放大試驗(yàn)。取2批丹參飲片按條件水提[4]，提取液濃縮上大孔吸附樹(shù)脂HPD300，用2 BV水除雜，再用3 BV的40%乙醇洗脫，洗脫液濃縮，噴霧干燥得丹酚酸B的純化物，測(cè)定純化物中丹酚酸B的含量。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)方程的建立以丹酚酸B的峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，丹酚酸B在11.48～574.22 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y=2.80X-10.37（r=0.999 9）。

2.2靜態(tài)吸附篩選樹(shù)脂比較分析各大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附量（）發(fā)現(xiàn)，HPD300、HPD400A、HPD600、HPD700、D101、AB8型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂的吸附量比較高，結(jié)合洗脫情況可見(jiàn)，HPD300和AB8型號(hào)大孔吸附樹(shù)脂吸附的丹酚酸B易于洗脫，所以初步選擇這2種樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)情況考察篩選樹(shù)脂。

10種樹(shù)脂靜態(tài)吸附及洗脫情況

樹(shù)脂型號(hào)吸附量

2.3根據(jù)動(dòng)態(tài)吸附優(yōu)選樹(shù)脂根據(jù)流出液體積和丹酚酸B的滲出量繪制大孔吸附樹(shù)脂HPD300和AB8的吸附曲線，從可以看出，大孔吸附樹(shù)脂HPD300的滲漏明顯小于AB8。大孔吸附樹(shù)脂AB8（a）和HPD300（b）的動(dòng)態(tài)吸附曲線2.4根據(jù)洗脫情況優(yōu)選樹(shù)脂水作為除雜溶劑較好，含有乙醇的溶劑不適合作為除雜溶劑，5%乙醇就可以造成2%丹酚酸B的損失，故選擇2 BV的水除去水溶性雜質(zhì)；40%乙醇是最佳的洗脫溶劑，3 BV 40%乙醇能洗脫出85%以上的丹酚酸B（）。大孔吸附樹(shù)脂AB8（a）和HPD300（b）的40%乙醇洗脫曲線2.5確定純化樹(shù)脂根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算HPD300和AB8