大孔吸附樹脂純化丹酚酸B的工藝研究

張翠英 章洪 王階

摘要[目的]利用大孔吸附樹脂優化丹參中高純度丹酚酸B的純化工藝。[方法]大孔吸附樹脂純化考察包括樹脂類型的選擇、上樣量、除雜溶劑、洗脫溶劑等多方面因素。[結果]確定丹參中丹酚酸B的純化樹脂為大孔吸附樹脂HP300、上樣量為1∶2（丹參∶樹脂）、2 BV水除雜、3 BV的40%乙醇洗脫。收集40%乙醇洗脫部分回收溶劑噴霧干燥，丹酚酸B純化物中丹酚酸B的含量為73.6%、68.9%。[結論]大孔吸附樹脂優化的純化條件為丹酚酸B進一步研究開發奠定了實驗基礎。

關鍵詞丹參；丹酚酸B；純化；大孔吸附樹脂

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07752-02

基金項目國家自然科學基金（81202932）；國家科技重大專項（2013ZX09301307）。

作者簡介張翠英（1972- ），女，遼寧喀左人，副研究員，博士，從事中藥藥效成分的研究。*通訊作者，主任醫師，博士生導師，從事心血管臨床研究。

收稿日期20140707丹酚酸B是丹參（唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖）中含量最高的水溶性有效成分，大量的藥理研究表明丹酚酸B具有較強的抗氧化、保護心肌和缺血再灌注損傷等作用[1-3]，在心腦血管疾病方面具有明確穩定的療效。該試驗是在前期研究的基礎上[4]，篩選純化丹酚酸B的大孔吸附樹脂，優選大孔吸附樹脂純化丹酚酸B的純化工藝條件，為相關丹酚酸B制劑的開發應用奠定實驗基礎。

1材料與方法

1.1儀器Agilent 1200型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機、DAD檢測器（安捷倫公司）；METTLER AB135S電子天平（瑞士）。HZS4水浴振蕩器（哈爾濱市東聯電子科技開發有限公司），B600B型臺式低速離心機（北京白洋醫用離心機有限責任公司），超純水系統（Millipore，USA）。

1.2材料大孔吸附樹脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD400A、HPD450、HPD500、HPD600、HPD700、D101、AB-8、DM130購自河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司。丹酚酸B對照品（批號11071331，上海同田生物技術有限公司），乙腈（色譜純，美國FISHER公司），冰醋酸（分析純，北京化工廠），乙醇（醫用乙醇）。丹參飲片購于中國中醫科學院廣安門醫院藥房，標示為北京豐泰金源藥業有限公司（批號12120602，產地山東），經張翠英副研究員鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖加工成的飲片。

1.3試驗方法

1.3.1色譜條件。Agilent TCC18 BDS（250×4.6 mm， 5 μm）色譜柱。流動相為乙腈 （A）1%醋酸（B），梯度洗脫分別為0～5 min、12%～20%A，5～10 min、20%～22%A；10～13 min、22%A，13～25 min、22%～30%A，25～35 min、30%～65%A，均為線性洗脫；流速為1.0 ml/min；檢測波長286 nm；柱溫35 ℃。

1.3.2標準貯備液的配制。精密稱取丹酚酸B對照品適量（5.74 mg）置10 ml棕色量瓶中，加75%甲醇配制成丹酚酸B對照品貯備溶液（0.574 mg/ml）。

1.3.3標準方程的建立。精密吸取貯備溶液適量分別配制成一系列濃度的對照品溶液（11.48、22.97、57.42、114.84、229.69、574.22 μg/ml），分別進樣5 μl，以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標進行線性回歸。

1.3.4丹酚酸B的含量測定。精密吸取樣品液或洗脫液進行適當稀釋，經0.45 μm濾膜過濾后進樣檢測，根據標準曲線計算丹酚酸B的含量。

1.3.5樹脂的預處理。選擇處理好的大孔吸附樹脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD400A、HPD450、HPD500、HPD600、HPD700、D101、AB-8適量，按照大孔吸附樹脂的用前處理方法，用乙醇浸泡4 h以上，上柱用乙醇沖洗，沖洗至無白色混濁物，流出液與水以1∶1的比例混合后仍澄清，再用水洗至無醇味。

1.3.6靜態吸附篩選樹脂。分別稱取5 g，置于錐形瓶中，分別加入已知丹酚酸B含量的丹參水提濃縮液100 ml，水浴恒溫（30 ℃）振搖（50轉/min）24 h；吸附后的溶液過濾，采用“1.3.1色譜條件”測定，計算每種樹脂的吸附量。同時將每種吸附丹參水提液的大孔吸附樹脂分別用不同比例的乙醇溶液（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇）依次洗脫，采用HPLC法測定洗脫液中丹酚酸B的含量。

1.3.7根據動態吸附優選樹脂。分別稱取預處理好的大孔吸附樹脂HPD300和AB8適量，裝入玻璃層析柱（內徑1.5 cm），精密吸取丹參水提濃縮液45 ml上樣，每5 ml流出液取樣一次，HPLC法測定丹酚酸B含量，根據流出液體積和丹酚酸B的滲出量繪制吸附曲線。

1.3.8根據洗脫情況優選樹脂。分別用水、5%、10%、30%、40%、50%、70%乙醇進行洗脫，根據丹酚酸B的含量優選除雜容劑和最佳洗脫溶劑。

1.3.9水提液上樣量的優化。取大孔吸附樹脂HPD300各5 g裝入3根層析柱，精密吸取丹參不同體積的水提濃縮液上樣，先用2 BV水除雜，再分別用40%乙醇5 BV洗脫，每1 BV洗脫液收集一次，HPLC法測定洗脫液中丹酚酸B的含量，計算大孔吸附樹脂HPD300對丹酚酸B滲漏和洗脫情況，確定丹參藥材和樹脂的最佳比例。

1.3.10丹酚酸B純化物的放大試驗。取2批丹參飲片按條件水提[4]，提取液濃縮上大孔吸附樹脂HPD300，用2 BV水除雜，再用3 BV的40%乙醇洗脫，洗脫液濃縮，噴霧干燥得丹酚酸B的純化物，測定純化物中丹酚酸B的含量。

2結果與分析

2.1標準方程的建立以丹酚酸B的峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標進行線性回歸，結果表明，丹酚酸B在11.48～574.22 μg/ml范圍內線性關系良好，其回歸方程為Y=2.80X-10.37（r=0.999 9）。

2.2靜態吸附篩選樹脂比較分析各大孔吸附樹脂的靜態吸附量（）發現，HPD300、HPD400A、HPD600、HPD700、D101、AB8型號大孔吸附樹脂的吸附量比較高，結合洗脫情況可見，HPD300和AB8型號大孔吸附樹脂吸附的丹酚酸B易于洗脫，所以初步選擇這2種樹脂進行動態情況考察篩選樹脂。

10種樹脂靜態吸附及洗脫情況

樹脂型號吸附量

2.3根據動態吸附優選樹脂根據流出液體積和丹酚酸B的滲出量繪制大孔吸附樹脂HPD300和AB8的吸附曲線，從可以看出，大孔吸附樹脂HPD300的滲漏明顯小于AB8。大孔吸附樹脂AB8（a）和HPD300（b）的動態吸附曲線2.4根據洗脫情況優選樹脂水作為除雜溶劑較好，含有乙醇的溶劑不適合作為除雜溶劑，5%乙醇就可以造成2%丹酚酸B的損失，故選擇2 BV的水除去水溶性雜質；40%乙醇是最佳的洗脫溶劑，3 BV 40%乙醇能洗脫出85%以上的丹酚酸B（）。大孔吸附樹脂AB8（a）和HPD300（b）的40%乙醇洗脫曲線2.5確定純化樹脂根據試驗結果計算HPD300和AB8