嘉興地區(qū)秸稈降解菌的資源調(diào)查（I）：部分霉菌的分類鑒定

葉童童 張孫燕 何杜鵑 于建興 李加友

摘要 [目的]對嘉興地區(qū)秸稈降解菌部分霉菌分類鑒定。[方法]利用形態(tài)分類學(xué)方法和基于ITS序列的分子鑒定，對環(huán)境中原位分離的15種秸稈降解霉菌進(jìn)行分類鑒定。[結(jié)果]1228屬于哈茨木霉；1105、1012屬于黑曲霉的不同菌株；1210、1234屬于塔賓曲霉的不同菌株；1219屬于赭曲霉；1021、1106、1110、1222、1229、1230、1232屬于卷枝毛霉的不同菌株；1237屬于米根霉；1109屬于球毛殼菌。[結(jié)論]通過對秸稈降解菌的資源調(diào)查，為高性能秸稈降解菌的選育奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 秸稈降解菌；形態(tài)學(xué)鑒定；ITS序列；嘉興地區(qū)

中圖分類號 S181.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）26-09107-04

Investigation of Straw-degradation Strains in Jiaxing （I）： Identification of Some Molds

YE Tong-tong， LI Jia-you et al （College of Biological and Chemical Engineering， Jiaxing University， Jiaxing， Zhejiang 314001）

Abstract [Objective] The research aimed to identify some molds decomposing straw in Jiaxing. [Method] By morphological taxonomy method and molecular identification based on ITS sequence， 15 kinds of straw-degradation molds in situ separating from the environment were identified. [Result] Strain 1228 belonged to Hypocrea lixii； strains 1105 and 1012 belonged to Aspergillus niger； strains 1210 and 1234 belonged to Aspergillus tubingensis； strain 1219 belonged to Aspergillus ochraceus； strains 1021， 1106， 1110， 1222， 1229， 1230 and 1232 belonged to Mucor circinelloides； strain 1237 belonged to Rhizopus oryzae； strain 1109 belonged to Chaetomium globosum. [Conclusion] Via resource survey on straw-degradation strains， it could lay foundation for breeding high-performance straw-degradation strains.

Key words Straw-degradation strain； Morphological identification； ITS sequence； Jiaxing

我國年產(chǎn)水稻秸稈1.8億t，其中資源化利用率不超過50%，大量水稻秸稈被廢棄或就地焚燒，對農(nóng)村環(huán)境和空氣質(zhì)量造成嚴(yán)重污染^[1]。利用生物發(fā)酵的方法可以將水稻秸稈轉(zhuǎn)化為燃料乙醇、飼料、栽培基質(zhì)和有機(jī)肥等^[2]，但由于生物轉(zhuǎn)化效率低，發(fā)酵周期長，影響了水稻秸稈的資源化利用和產(chǎn)品開發(fā)。水稻秸稈主要成分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，能以水稻秸稈為基質(zhì)的微生物包括多種細(xì)菌、霉菌等，其中霉菌最為常見和常用。自然環(huán)境中就存在大量可以降解水稻秸稈的微生物菌株，并且不同地區(qū)的水稻秸稈降解菌種類各異，現(xiàn)有的水稻秸稈降解菌基本都是從自然環(huán)境中篩選獲得^[3]。因此，開展天然水稻秸稈降解菌資源調(diào)查研究對水稻秸稈生物降解技術(shù)的發(fā)展具有意義。

1 材料與方法

1.1 秸稈 取自嘉興地區(qū)不同水稻種植單位的秸稈樣品10份，自然風(fēng)干后粉碎過篩備用，篩孔直徑1 mm。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 ml，pH自然，121 ℃滅菌20 min。沙堡氏液體培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，水1 000 ml，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 分子鑒定用試劑

Ezup 柱式基因組DNA抽提試劑盒（真菌）、瓊脂糖H、DNA marker F、PCR試劑、SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。其中PCR上下游引物分別為ITS1：TCCgTAggTgAACCTgCgg，ITS4：TCCTCCgCTTATTgATATgC。

1.4 秸稈降解菌株的分離純化

取不同來源的秸稈為培養(yǎng)基質(zhì)，加入適量的無菌水和無機(jī)氮源，裝瓶后于28 ℃恒溫培養(yǎng)。定期檢測培養(yǎng)瓶中秸稈表面微生物生長情況，適時將長出的菌株進(jìn)行分離純化并編號，然后將所得的純菌株重新接種于無菌的秸稈培養(yǎng)基質(zhì)上，選擇生長狀況良好的菌株作為秸稈降解菌，并保藏。

1.5 形態(tài)學(xué)分類鑒定

將斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接至PDA平板上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)1～2 d，待菌絲長出后，用接種鏟鏟取菌絲至新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。取約0.5×0.5 cm大小的菌絲塊置于鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)5 d 至菌絲長滿平板，最后將純化的菌絲塊移至 PDA培養(yǎng)基上斜面培養(yǎng)保藏待用^[4]。

1.5.1 菌落觀察。無菌條件下，用接種針挑取純化分離斜面培養(yǎng)基中單菌落孢子，采用單點(diǎn)接種法接種于PDA培養(yǎng)基當(dāng)中，將霉菌28 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察并記錄PDA平皿菌落特征，包括菌落的正背面顏色、菌落直徑、菌落質(zhì)地、表面、邊緣、透明程度、隆起度、特殊氣味、干濕情況、有無分泌物等^[5]。

1.5.2 顯微觀察。 制備臨時玻片，從菌落的邊緣挑取少許菌絲和孢子置于生理鹽水中，加蓋玻片。顯微鏡下觀察并記錄菌種的顯微形態(tài)，包括分生孢子頭、頂囊、瓶梗、梗基、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子等^[6]。

1.5.3 菌種形態(tài)鑒定。參照《真菌鑒定手冊》，根據(jù)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察結(jié)果，對秸稈降解菌進(jìn)行分類^[7]。

1.6 ITS區(qū)序列分析 DNA提取、ITS序列擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物回收均參照試劑盒使用指南和文獻(xiàn)方法。基因序列測定由上海生工完成。

1.7 生物信息分析 用 chromas 軟件對PCR 產(chǎn)物測序圖譜分析，用 lasergene 軟件對 PCR 產(chǎn)物序列進(jìn)行處理與比對，并構(gòu)建分子進(jìn)化樹，對不同菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行判定。最后，在NCBI上對所得序列進(jìn)行 BLAST分析，通過比較與已知序列的同源程度，綜合形態(tài)學(xué)特征以確定菌株的分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈降解菌的分離純化

對嘉興地區(qū)不同來源的秸稈進(jìn)行培養(yǎng)后，獲得純化的菌株103株，經(jīng)過定性檢測后，選取其中秸稈降解能力較強(qiáng)的15株霉菌進(jìn)行分類鑒定，待測菌株編號分別為1012、1021、1105、1106、1109、1110、1210、1219、1222、1228、1229、1230、1232、1234、1237。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

對15個菌株菌落的形狀、顏色、邊緣、隆起度、干濕度、特殊氣味、色素、透明度、氣生菌絲、孢子顏色等特征進(jìn)行觀察描述；同時利用顯微鏡觀察各菌株的分生孢子頭、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、頂囊、瓶梗、梗基、分生孢子等顯微形態(tài)。根據(jù)《真菌鑒定手冊》對15株真菌進(jìn)行了初步鑒定，發(fā)現(xiàn)上述秸稈降解菌分別屬于木霉屬、曲霉屬、毛霉屬、根霉屬、毛殼菌屬。

2.2.1 曲霉屬。菌株1012、1105、1210、1219、1234屬于曲霉屬。各菌的菌落形態(tài)基本一致，但也略有不同（表 1）。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌絲無色、淡色或表面凝集有色物質(zhì)，有隔膜。分生孢子梗從足細(xì)胞垂直生出，大多數(shù)無橫隔，光滑或粗糙，上部較粗大，頂端膨大成球形、橢圓形、半圓形或棒球形的孢囊；從孢囊的全部表面以放射狀生出小梗或僅在孢囊頂部產(chǎn)生小梗；小梗單層或在頂部再分枝成2個至多個小梗。分生孢子串生于小梗頂端，作輻射狀排列或叢集成柱狀，著色、形狀、大小和紋飾的變化很大（圖 1）。初步鑒定為真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、曲霉目、曲霉科的曲霉屬（Aspergillus）。

2.3 分子鑒定

2.3.1 DNA提取與檢測。對15個秸稈降解菌菌株分別提取基因組DNA，進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果表明，提取的DNA質(zhì)量完好，可進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增試驗。

2.3.2 PCR擴(kuò)增與檢測。以 ITS1 和 ITS4 為引物，以各菌株的 DNA 為模板，擴(kuò)增ITS序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，進(jìn)行電泳檢測，根據(jù) DNA marker的片段大小推測各產(chǎn)物大小在500～700 bp左右，不同菌株的ITS序列長度略有不同。結(jié)果表明，擴(kuò)增的ITS片段純度高，可進(jìn)行測序。

2.3.3 ITS序列分析。對15種秸稈降解菌的ITS序列進(jìn)行BLAST分析，由表3可知，1228屬于哈茨木霉（Hypocrea lixii/Trichoderma harzianum）；1105、1012屬于黑曲霉（Aspergillus niger）的不同菌株；1210、1234屬于塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）的不同菌株；1219屬于赭曲霉（Aspergillus ochraceus）；1021、1106、1110、1222、1229、1230、1232屬于卷枝毛霉（Mucor circinelloides）的不同菌株；1237屬于米根霉（Rhizopus oryzae）；1109屬于球毛殼菌（Chaetomium globosum）。其中菌株1021、1106和1110可能為新種，有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論與討論

以菌落形態(tài)、顯微形態(tài)和生理生化特征為依據(jù)的表型分類法是一種傳統(tǒng)的分類鑒定方法，但考慮到真菌具有形態(tài)特征復(fù)雜、種類繁多等特點(diǎn)，且一些菌種的生理生化指標(biāo)和形態(tài)特征受多種內(nèi)環(huán)境及外環(huán)境因素的影響，因此對其采用傳統(tǒng)分類方法進(jìn)行分類存在較大的主觀性。分子鑒定除了具有簡便、快速、分辨率高等一般特點(diǎn)，亦可進(jìn)行多相分類鑒定，更能按照種系進(jìn)化的保守序列的關(guān)系精確地確定種類，使分類鑒定結(jié)果顯得更加的客觀合理^[9]。但是由于秸稈降解菌還在不斷被開發(fā)中，受高度同源性序列的多少、基因庫完善程度及具體物種ITS區(qū)的可變程度等影響，因此必須與傳統(tǒng)的真菌形態(tài)鑒定方法結(jié)合才能取得精確的鑒定結(jié)果。

該研究綜合形態(tài)學(xué)鑒定及分子鑒定，初步判斷15種秸稈降解菌分別為：1228屬于哈茨木霉；1105、1012屬于黑曲霉的不同菌株；1210、1234屬于塔賓曲霉的不同菌株；1219屬于赭曲霉；1021、1106、1110、1222、1229、1230、1232屬于卷枝毛霉的不同菌株；1237屬于米根霉；1109屬于球毛殼菌。查取各菌的相關(guān)信息，證實其確有降解纖維素或木質(zhì)素的能力，對降解秸稈有重要意義，為秸稈降解菌的開發(fā)利用提供了有力的依據(jù)。并采用斜面低溫保藏法及低溫干燥保藏法對15種菌進(jìn)行了保藏，采用麩皮培養(yǎng)，有利于純化菌種，提高秸稈降解菌質(zhì)量，既可以作擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)用，又可用保藏菌種。這樣既滿足了實驗室對菌種的需求，又防止了菌種的退化，對生物資源的開發(fā)利用和保護(hù)意義重大。

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