動物組織中氟苯尼考殘留的半定量快速檢測膠體金試紙條的研制

孫素玲 徐園芳

摘要[目的]為動物組織中氟苯尼考殘留快速檢測試紙條的制備奠定基礎。[方法]采用琥珀酸酐法制備氟苯尼考人工半抗原，用活潑酯法將氟苯尼考人工半抗原與牛血清蛋白進行偶聯制備氟苯尼考人工抗原。紫外光譜法和光譜分析法對氟苯尼考人工抗原FFCHSBSA進行鑒定。[結果]與BSA和FFC相比， FFCHSBSA的最大吸收峰發生了變化，曲線形狀也發生了改變，FFC-HS與BSA的偶聯比為18.9∶1。[結論]FFC-HS-BSA人工抗原的合成是成功的，其偶聯比在最適范圍內。

關鍵詞氟苯尼考；人工抗原；琥珀酸酐法；活潑酯法；偶聯比

中圖分類號S859.84文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07757-02

基金項目安徽科技學院自然科學研究項目（ZRC201425）。

作者簡介 孫素玲（1958-），女，安徽碭山人，教授，從事獸藥殘留檢測的研究。

收稿日期20140627氟苯尼考是酰胺醇類第3代動物專用抗菌藥，具有廣譜、高效、吸收好、體內分布廣、無致再生障礙性貧血作用等特點，作為氯霉素的替代藥物被廣泛用于治療畜禽的細菌性疾病[1]，還用作豬的飼料添加劑來預防和治療豬的細菌性疾病[2]。研究表明，氟苯尼考具有胚胎毒性和耐藥性，在畜禽生產上的大量應用也導致其在畜禽產品中殘留，危害公眾健康。歐盟、日本等國均制定了動物食品中氟苯尼考的最大殘留量標準，我國農業部235號公告也對其殘留限量做出了嚴格規定。

目前，檢測動物性食品中氟苯尼考殘留的檢測方法主要是色譜分析法[3-4]和免疫分析方法（如酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和ELISA試劑盒等）[5]。色譜分析法具有準確、敏感的優點，但也具有檢測需要時間長、樣品前處理比較復雜、操作煩瑣、需要特殊的儀器、成本高等缺點。免疫分析法具有簡便、靈敏度高、特異性好等優點。動物組織中氟苯尼考殘留的半定量快速檢測膠體金試紙條制備是屬于免疫分析方法，建立氟苯尼考殘留免疫分析方法最關鍵的一步是氟苯尼考人工抗原的合成。筆者對氟苯尼考人工抗原進行合成與鑒定，為氟苯尼考抗體的制備及動物組織中氟苯尼考殘留快速檢測試紙條的制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 主要試劑。氟苯尼考，純度≥99.0%，購自武漢三洹醫藥化工有限公司；牛血清白蛋白（BSA），含量≥98%，購自上海源聚生物科技有限公司；琥珀酸酐，AR級，含量≥99%，購自陜西省渭南市惠豐化學工業有限責任公司；N，N二甲基甲酰胺（DMF），AR級，購自天津市大茂化學試劑廠；N羥基琥珀酰亞胺（NHS，含量≥99%），AR級，購自上海金穗生物科技有限公司。

1.1.2主要儀器。 YP600型電子天平，購自上海精密科學儀器有限公司； BCD502F型冰箱，購自青島海爾冰箱股份有限公司；TLD802B型離心機，購自上海安亭科學儀器廠；752型紫外光分光光度計，購自南京麒麟分析儀器有限公司；JB1A攪拌器（雷磁），購自上海夢漢實業有限公司。

1.2方法

1.2.1氟苯尼考人工抗原的制備。

1.2.1.1氟苯尼考-半琥珀酸酯（FFCHS）的制備[6]。參照文獻[6]方法，氟苯尼考（FFC） 6.0 g 、琥珀酸酐4.5 g攪拌溶于45 ml無水吡啶中， 60 ℃ 回流反應24 h，旋轉蒸器中蒸去吡啶，用60 ml乙酸乙酯復溶蒸干物，轉至250 ml分液漏斗中， 待溶液分層后，用0.5 mol/L HCl 40 ml洗滌3次，三蒸水40 ml洗滌3次，得到橙紅色溶液。減壓濃縮上述溶液， 避光真空干燥48 h后得到粉紅色單酯粗品FFCHS。

1.2.1.2 FFCHS與BSA的偶聯（活潑酯法）[7]。參照文獻[7]的方法，用4 ml的N，N二甲基甲酰胺溶解500 mg的半抗原，再加入270 mg N羥基琥珀酰亞胺和460 mg N，N二環己基碳酰亞胺， 室溫避光攪拌24 h。將反應液2 000 r/min 離心10 min， 棄去沉淀，上清液即為制備的氟苯尼考活化中間產物。將氟苯尼考活化中間產物在攪拌下逐滴加到含100 mg BSA的16 ml PBS中，攪拌1 h后轉至4 ℃下攪拌48 h。4 ℃攪拌下，用pH7.4的0.01 mol/L PBS透析，每8 h換液1次，透析2 d。2 000 r/min離心10 min，取上清液得到FFCHSBSA人工抗原。小量分裝，-20 ℃下保存。

1.2.2氟苯尼考人工抗原的鑒定。

1.2.2.1 FFCHSBSA溶液的蛋白濃度測定（雙縮尿法）[8]。根據文獻[8]的方法，將透析好的FFCHSBSA適當稀釋后，測定在260和280 nm波長處的吸光度值，按照以下公式計算蛋白濃度：蛋白濃度（mg/ml）=1.45OD280 nm-0.74 OD260 nm。

1.2.2.2紫外光譜法鑒定FFCHSBSA人工抗原的合成。氟苯尼考在紫外區能產生明顯的吸收光譜。用PBS將BSA、透析好的FFCHSBSA均配成100 μg/ml質量濃度，用甲醇溶解FFC配成100 μg/ml質量濃度。 FFC用甲醇作參比，其余均用稀釋液PBS作參比，在200～400 nm紫外光區對FFCHSBSA溶液、BSA溶液和FFC溶液進行光譜掃描，通過數據和圖譜的對比可證明偶聯成功與否。

1.2.2.3 FFCHSBSA人工抗原結合比的測定（光譜分析法）[9]。根據上述用紫外分光光度計測定出的FFC的最大吸收波長，在FFC最大吸收波長下測定FFCHSBSA和BSA的吸光度值，按照以下公式計算FFCHSBSA人工抗原結合比：

結合比=∑偶聯物-∑蛋白質∑半抗原

=（A偶聯物-A蛋白質）×C半抗原×M蛋白質A半抗原×M半抗原×C蛋白質

式中，A為吸光度；M為相對分子質量；C為質量濃度/（mg/ml）。

2 結果與分析

2.1氟苯尼考人工抗原的鑒定

2.1.1 FFCHSBSA溶液的蛋白濃度。經雙縮尿法測定的FFCHSBSA中蛋白質質量濃度為3.30 mg/ml。

2.1.2紫外光譜法鑒定FFCHSBSA人工抗原的合成。從可以看出，FFC在233 m波長處有最大吸收峰，BSA在214 nm波長處有最大吸收峰， FFCHSBSA在229 nm波長處有最大吸收峰。 FFCHSBSA與BSA和FFC相比，不但最大吸收峰發生了變化，曲線形狀也發生了改變，表明FFCHSBSA人工抗原的合成是成功的。

FFC、BSA和FFCHSBSA的紫外掃描圖譜2.1.3 FFCHSBSA人工抗原結合比。根據紫外掃描圖，FFC的最大吸收波長為233.0 nm，在233.0 nm波長處測定的FFCHSBSA與BSA的吸光度分別為1.077和0.44，計算出的BSA與半抗原的結合比為18.9∶1 。

3討論

人工抗原的合成在獸藥殘留的免疫分析方法中是最關鍵的環節，人工抗原的質量直接決定著抗體的效價和特異性[9]。FFC是半抗原，本身并不具備免疫原性，必須和載體蛋白偶聯才能成為完全抗原。FFC分子結構中沒有與載體蛋白連接的功能性基團氨基（-NH2）和羧基（-COOH），必須先將FFC分子結構進行改造成具有氨基或者羧基。筆者利用FFC分子結構上所帶的羥基（-OH），用琥珀酸酐作 “間隔臂”，將其改造成具有羧基（-COOH）的活性半抗原FFCHS。為了防止載體蛋白之間的交叉反應，筆者選用BSA作為載體蛋白，用活潑酯法將FFCHS的羧基與載體蛋白BSA上的氨基相聯，合成含CONH鍵的FFCHSBSA人工抗原。

FFC與載體蛋白的偶聯效果如何將直接影響FFCHSBSA人工抗原的免疫效果，筆者利用紫外掃描法和FFCHS與載體蛋白之間的結合比測定對FCHSBSA偶聯效果進行分析。紫外掃描法結果表明FFCHSBSA與BSA和FFC相比，不僅最大吸收峰發生了變化，而且曲線形狀也發生了改變，表明人工抗原FFCHSBSA的合成是成功的。人工抗原的特異性還與其載體蛋白上連接的半抗原數目有關。通常每個載體蛋白上含有8～25個半抗原時能取得較好的免疫效果[9-11]。筆者測定了FFCHSBSA人工抗原結合比，計算出BSA與FFCHS的結合比為18.9∶1，屬于最適結合比范圍之內，從理論上來看應該得到效價較高的抗體。筆者采用低速離心和透析來提高FFCHSBSA人工抗原的純度，離心除去變性的載體蛋白，用PBS對FFCHSBSA透析2 d，除去了未反應的氟苯尼考、琥珀酸酯等小分子，保證了FFCHSBSA人工抗原的純度。

參考文獻

[1] 李孝文，章洪皸，宋文超，等.氟苯尼考研究進展及其在豬場使用建議[J].用藥指南，2012（8）：52-56.

[2] 邱銀生，吳佳.獸用光譜抗菌藥氟甲砜霉素[J].中國獸藥雜志，1996，30（2）：47-48.

[3] 孫豐云，張素霞，沈建忠，等.蝦肉中氯霉素甲砜霉素氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留氣相色譜-微電子捕獲檢測法[J].中國獸醫雜志，2006，42（10）：66-67.

[4] 魏海濤，方秋華，曾振玲，等.高效液相色譜法測定豬血漿中氟苯尼考含量[J].廣東畜牧獸醫科技，2010，35（3）：31-33.

[5] 馮才茂，賈瑜，馬孝斌，等.氟苯尼考殘留的酶聯免疫檢測方法的研究[J].北京工商大學學報：自然科學版，2012，30（4）：50-53.

[6] 駱鵬杰，張素霞，梁春來，等.氟苯尼考人工抗原的合成與鑒定[J].中國獸醫雜志，2009，45（9）：87-89.

[7] 趙朋玲，鄭海濤，姜盼盼，等.兩種方法制備氟苯尼考人工抗原及其鑒定[J].食品科學，2010，31（15）：225-230.

[8] 陳鈞輝，陶力，李俊，等.生物化學實驗[M].北京：科學出版社，2003：197-199.

[9] 孫法良， 刁有祥，劉悅竹，等.氟苯尼考人工抗原的合成與鑒定[J].福建農業學報，2009，24（1）：24-28.

[10] 榮康泰，徐勤惠，李根令，等.半抗原與載體的最佳分子結合比[J].中國生物化學與分子生物學報，1985，1（2）：27-31.

[11] LI Q X，ZHAO M S，GEE S L，et al.Development of enzymelinked immunosorbent assays for 4nitrophenol and substituted 4nitrophenols[J].J Agric Food Chem，1991，39： 1685-1692.安徽農業科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（23）：7759，7780