重組斑馬魚IL—蛋白的真核表達

婁婧婧 陳偉民 趙廣才

摘要[目的]在昆蟲S2細胞中重組表達斑馬魚IL10蛋白。[方法]PCR擴增斑馬魚IL10蛋白編碼基因，連接到分泌表達載體pMT/Bip/V5-His A中與輔助質粒pCoBlast共轉染S2昆蟲胚胎細胞，通過Blasticidin加壓篩選，獲得穩定表達斑馬魚IL10的細胞系。用硫酸銅誘導IL10蛋白表達，收集無血清的細胞表達上清，采用SDSPAGE及Western鑒定目的蛋白。[結果]目的蛋白在昆蟲細胞中獲得表達，SDSPAGE結果表明相對分子質量為23 kD，與預期結果相一致。[結論]獲得了重組斑馬魚IL10蛋白，為進一步在蛋白水平上研究其功能和調控機制奠定了基礎。

關鍵詞斑馬魚；IL10蛋白；S2細胞；真核表達

中圖分類號S965.119文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07769-04

作者簡介婁婧婧（1986- ），女，湖南長沙人，研究實習員，碩士，從事食品安全生物學研究。

收稿日期20140710細胞因子由造血系統、免疫系統或炎癥反應中的活化細胞產生，能調節細胞分化增殖和誘導細胞發揮功能，是高活性功能的多肽、蛋白質或糖蛋白。細胞因子及其構成的網絡在免疫調節方面起著重要。白細胞介素10（IL10）是一種細胞因子，主要由Th2細胞產生，是能抑制Th1細胞釋放細胞因子（IFNγ和IL2等）的免疫調節性細胞因子[1]。研究表明，IL10能抑制炎癥介質因子的分泌，是非常有效的抗炎介質，在體液免疫中起重要作用[2]。動物和人體的各種體內研究表明，IL10治療可以降低炎癥的嚴重程度[3]。

在人類和魚類的基因組中，IL10基因的大小大約為2 kb。第1個外顯子編碼信號肽和A螺旋結構。第2個外顯子編碼AB魯普結構和B螺旋結構。第3個外顯子編碼C和D螺旋結構。第4個外顯子編碼DE魯普結構和E螺旋結構。第5個外顯子編碼F螺旋和羧基端的尾巴以及1個不翻譯的包括AUUUA的片段，當這個片段與AUF1結合時，會降低IL10mRNA的穩定性[4]。

鱖魚傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus， ISKNV）是近年來廣東鱖魚養殖業爆發性流行病的主要病因之一，造成了巨大的經濟損失。ISKNV以鱖魚脾和腎為主要侵入組織，引起脾腎細胞的腫大和壞死。近年來，越來越多的學者通過研究ISKNV病毒作用機制來探討魚類天然免疫機制。國內研究表明，ISKNV感染斑馬魚后斑馬魚體內的IL10含量迅速升高[5]。據此推測，IL10參與了魚類的免疫調節，但其作用機制有待進一步研究。為此，筆者構建了斑馬魚IL10基因真核表達載體，融合表達并純化了IL10蛋白，以期為進一步的生物學功能研究奠定了基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料大腸桿菌 DH5α感受態細胞由實驗室保存；真核表達載體pMT/Bip/V5-His A購自英俊公司，PCR膠回收、質粒提取試劑盒購自Omega公司；DNA Marker、限制性內切酶KpnⅠ、XhoⅠ及T4 DNA 連接酶、高保真DNA聚合酶均購自TaKaRa 公司；Schneiders Drosophila Medium和FBS、Cellfectin轉染試劑均購自Invitrogen公司；antiV5 antibody購自Sigma公司；低分子量標準蛋白購自大連寶生物公司；其他試劑均為國產分析純試劑，購自威佳公司。

1.2斑馬魚IL10基因真核表達載體的構建從斑馬魚脾臟組織中提取RNA反轉錄成cDNA，以此cDNA為模板，結合真核表達載體pMT/Bip/V5-His A的多克隆位點和IL10基因的限制性酶切位點，根據NCBI網站上斑馬魚IL10基因的編碼序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計擴增引物。在上下游引物的5端分別加上KpnⅠ和XholⅠ的酶切位點，引物序列為：DIL10PF： 5 GGGGTACCcAGGAGAGTCGAATGCAAAAC 3；DIL10PR： 5 CCGCTCGAGGTGCTTAACCCTCTTTGAG 3。

PCR反應體系包括0.5 μmol/L 正向/反向引物、2 ng cDNA 模板、dNTP 混合液各2.5 mmol/L、緩沖液（添加Mg2+）、Kodplus DNA 聚合酶0.025 U，用滅菌三蒸水補齊至50 μl。PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s 30個循環；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用試劑盒回收目的片段的擴增產物。分別用XhoⅠ和KpnI雙酶切純化產物和真核表達載pMT/Bip/V5-His A，回收雙酶切片段，T4 DNA 連接酶16 ℃連接過夜，構建pMT/Bip/V5-His A-IL10的真核表達質粒，轉化大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素抗性平板上挑取單克隆37 ℃振蕩培養，菌液PCR篩選陽性克隆后測序[6]。引物合成和測序均由上海英俊生物工程有限公司完成。

1.3IL10蛋白的真核表達及穩定細胞系的篩選用試劑盒提取測序驗證無誤的目的重組菌的無內毒素質粒待用。取無血清SDM培養基培養的S2單層細胞轉板后培養待其貼壁生長并達到一定密度后，將無內毒素質粒及Cellfectin轉染細胞，28 ℃下培養18 h，棄去舊培養液，加入含10%FBS的培養基（添加雙抗）繼續培養。轉染后的細胞培養約3～5 d，待其生長到分裂期，將原培養基換成添加抗生素（Blasticidin）的10%FBS的SDM培養基繼續培養，篩選穩定表達的細胞系。篩選細胞過程中約4～5 d換液1次，篩選14 d后開始擴大培養。在轉染后篩選細胞前和篩選細胞并擴大培養后，分別用硫酸銅誘導蛋白表達。在培養基中加入500 μg/ml的硫酸銅，將細胞置于28 ℃條件下繼續培養。

1.4IL10蛋白的純化取篩選后誘導的細胞，在誘導后第4天開始收集細胞上清，將上述濾液過Ni2+金屬螯合層析柱，用Novagen公司的His.Bind 純化試劑盒，通過鎳螯合層析純化His-Tag 融合蛋白。用含不同濃度咪唑（60和120 mmol/L）的洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，6 mol/L尿素，pH8.0）梯度洗脫后，進行SDS-PAGE蛋白檢測。

1.5IL10蛋白的檢測及Western blotting分析按照常規方法處理樣品進行SDSPAGE，檢測蛋白的表達情況。Western blot分析，將SDS-PAGE凝膠上的條帶轉移到硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂乳封閉，用antiV5 抗體作為一抗，以1∶5 000倍稀釋的羊抗兔IgG（堿性磷酸酶標記）作為二抗，經NBT/BCIP顯色，觀察特異性條帶[7]。

2結果與分析

2.1IL10基因的PCR擴增以提取斑馬魚脾臟組織RNA反轉錄的cDNA作為模板，利用設計的上游引物PF和下游引物PR進行擴增，產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳可見清晰的目的片斷擴增條帶，條帶大小為474 bp與設計長度相符，且未出現其余雜帶，擴增的特異性良好。

2.2 pMT/Bip/V5His AIL10的真核表達質粒的酶切鑒定從可以看出，酶切后產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳可見2條清晰條帶，1條為pMT/Bip/V5His A載體條帶3.6 kb，另1條為IL10基因目的片段（474 kb），證明pMT/Bip/V5His AIL10真核表達載體構建成功，測序驗證目的片段序列也與IL10的序列相符。

注：M.DL1000 Marker；1.PCR擴增產物。

IL10基因的PCR擴增結果注：M.DL1000 Marker；1.陽性克隆的產物。

重組質粒的雙酶切鑒定2.3篩選穩定表達的細胞系培養S2細胞待其生長良好貼壁達到一定密度后拍照，轉染細胞后與篩選初期和后期分別拍照。發出熒光的細胞均為成功轉染的細胞。從中可以看出，細胞轉染效率較高；加壓篩選后，熒光細胞的密度顯著增大。

注：A.正常生長的S2細胞；B.轉染后未經篩選的S2細胞；C.加壓篩選后的細胞。

S2轉染細胞的篩選結果2.4細胞表達上清的SDSPAGE及 Western blot鑒定從可以看出，純化前細胞上清的電泳條帶中可見目的條帶和雜帶；純化后23 kD處出現清晰的條帶，大小與重組IL10蛋白相符；經Western blot后，在纖維素膜的預期位置出現特異性條帶，進一步驗證了細胞表達的正確性。

3討論

3.1斑馬魚IL10基因的序列分析幾種脊椎動物的IL10基因已經被克隆出來，比如人、老鼠、鳥類和魚類。結果表明，魚類IL10的表達模式與哺乳動物不同，魚類中不同種類的魚的表達模式也不同。斑馬魚的IL10氨基酸序列與其他已知的IL10氨基酸序列相似度為29.7%～80.9%，斑馬魚和普通草魚的相似度最高，達到80.9%[2]。國外的研究表明，IL10基因在同一家族的魚中是高度保守的。

3.2斑馬魚IL10基因的真核表達果蠅胚胎細胞表達系統（Drosophila Schneider 2 cell expression system）是一個高效表達外源蛋白的系統，該系統因表達質粒的不同分為組成性表達和分泌型表達，穩定表達細胞系的的篩選過程是在篩選壓力下將外源基因整合到果蠅基因組中的過程。分泌蛋白注：M.標準蛋白Marker ；1.純化前；2.純化后；3.Western blot結果。

細胞上清的SDSPAGE及Western鑒定42卷23期婁婧婧等重組斑馬魚IL10蛋白的真核表達幾種已知IL10氨基酸序列的比較的表達是在金屬硫蛋白（MT）的控制下的，在鋅、銅、錳、鐵、鉬等金屬離子的誘導下，該系統可啟動高效的外源蛋白表達[8-10]。

果蠅S2表達系統具有許多其他表達系統所無法比擬的優越性。首先，許多種類的載體都可以在S2細胞中表達目的重組蛋白，選擇pMT/Bip/V5His A載體是因為IL10是分泌到細胞外的蛋白，而pMT/Bip/V5His載體包括果蠅細胞分泌信號，可誘導表達分泌目的蛋白[11]。其次，此系統為真核表達系統，可以對目的蛋白進行真核表達系統的修飾。由于該試驗的研究對象是斑馬魚，使用真核表達系統來表達IL10就比使用原核表達系統更好，更適用于斑馬魚的研究。再次，此表達系統能在半個月獲得穩定表達目的蛋白的細胞系，比起其他真核表達系統耗時較短。國內已有人已經成功運用這個表達系統獲得了干擾素有活性的蛋白，且表達的蛋白量大約為1 ml上清中有2 μg目的蛋白[12]，因此通過這一表達系統便于獲取有活性的斑馬魚IL10蛋白，為進一步研究奠定了基礎。

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