柱前衍生高效液相色譜法測定植物油中黃曲霉毒素B1

馮民賢 賴春華

摘要 [目的]建立柱前衍生高效液相色譜法測定植物油中黃曲霉毒素B₁含量的方法。[方法]樣品甲醇水溶液（45+55）、三氯甲烷提取濃縮之后，用苯乙腈（2+98）溶解，三氟乙酸衍生，反相C18柱分離，熒光檢測器檢測，所用激發及發射波長依次為365、440 nm。[結果]試驗表明，黃曲霉毒素B₁線性關系良好，對添加黃曲霉毒素B₁的樣品進行加標回收試驗，回收率在89.5%，重復性試驗相對標準偏差（n=6）為2.34%。[結論]該法操作簡單、線性范圍廣、效果良好，可用于測定植物油中黃曲霉毒素B₁的含量。

關鍵詞 黃曲霉毒素B₁；高效液相色譜；柱前衍生；植物油

中圖分類號 S609.9 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）26-09180-01

Determination of Aflatoxin B₁in Vegetable Oil by HPLC with Pre-column Derivatization

FENG Min-xian et al （Liuzhou Product Quality Supervision and Inspection Institute， Liuzhou， Guangxi 545006）

Abstract [Objective] To establish the method for determining aflatoxin B₁in vegetable oil by pre-column derivatization with HPLC. [Method] Aqueous methanol （45+55） and chloroform after extraction and concentration， were dissolved in benzene acetonitrile （2+98）， derived from trifluoroacetic acid， separated by reversed phase C18 column and detected by fluorescence detector， excitation and emission wavelengths were 365 and 440 nm. [Result] The results showed that aflatoxin B₁has a good linear relationship， spiked recovery test was conducted on samples with aflatoxin B₁， recovery rate was 89.5%， repeatability relative standard deviation （n=6） is 2.34%. [Conclusion] The method is simple， and has wide linear range and good effect， which can be used for determination of aflatoxin B1 in vegetable oil.

Key words Aflatoxin B₁； HPLC； Pre-column derivatization； Vegetable oil

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生蟲產生的一組結構類似的代謝產物，具有極強的毒性，被世界衛生組織定為1類致癌物質^[1]。黃曲霉毒素廣泛存在于糧油制品中，尤其以黃曲霉毒素B₁為多。為了控制食品中黃曲霉毒素的含量，目前世界各國都規定了其在植物油中的最大限量，國家標準GB2761-2011規定了花生油黃曲霉毒素 B₁的含量不大于20 μg/kg，其他植物油為10～20 μg/kg。

目前國際上測定黃曲霉毒素B₁常見的方法有薄層層析法（TLC）^[2]、酶聯免疫分析法（ELIAS）^[3]、高效液相色譜法配柱后衍生系統^[4]。薄層層析法，其步驟多，測定時間長，干擾因素多，試劑耗費大，靈敏度低，熒光強度的目測精確性較差，特異性不強且安全性較差，主要用于半定量測定。酶聯免疫分析法其靈敏度高，特異性強，分析速度較快，其缺點主要在于影響因素較多，容易出現假陽性造成誤判。高效液相色譜法分離能力強，靈敏度高，特異性好，其檢測結果可靠。

國家標準采用TLC和HPLC（配柱后衍生系統）測定植物油黃曲霉毒素B₁的含量，TLC中采用紫外點樣分析方法，在熒光檢測下觀察藍色的熒光點，此法檢出限高，且偏差較大。因此，建立一種快速檢測植物油中黃曲霉毒素B₁的方法是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料 供試6種植物油分別為大豆油1、大豆油2、花生調和油1、花生油1、花生調和油2、花生油2。島津LC-20AT高效液相色譜儀，配有熒光檢測器，氮吹儀，恒溫培養箱，漩渦混合器。主要試劑：黃曲霉毒素B₁標準品（國家標準物質中心），甲醇（色譜級），乙腈（色譜級），三氟乙酸（分析純），水（三級用水），石油醚（分析純），三氯甲烷（分析純）。

1.2 方法

1.2.1 提取。稱取10 g（0.01 kg）樣品、加30 ml石油醚（60～90 ℃沸程）溶解，轉入分液漏斗中，加30 ml甲醇水（45+55）分數次洗滌燒杯，一并倒入分液漏斗中，搖勻，靜置數分鐘；把下層液體轉入另一個分液漏斗中，加30 ml三氯甲烷，搖勻，靜置分層，收集下層溶液，揮發近干，加1.5 ml苯-乙腈溶解定容，待衍生。

1.2.2 衍生。取上述溶液200 μl加200 μl三氟乙酸衍生，漩渦后，放入50 ℃恒溫干燥箱中衍生5 min，氮吹儀吹干，用流動相定容1 ml，經0.45 μm濾膜過濾，待上機。

1.2.3 色譜條件。色譜柱：C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈水（13+75）∶甲醇=75∶25；檢測波長：激發波長365 mm，發射波長440 mm；進樣量10 μl；流速1.0 ml/min。

1.2.4 標準溶液配制。標準品濃度為1 μg/ml，體積1 ml，用苯乙腈定容至5 ml，得0.2 μg/ml標準使用液。分別取50、100、200、400、800 μl衍生，氮吹儀吹干，定容1 ml，得進樣濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 μg/ml。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

在研究選用不同比例的流動相，采用NY/T1286-2007標準第8.3.2條為甲醇∶水∶乙腈=13∶75∶12，色譜峰在18 min出峰，且峰形寬大、不對稱。經多次研究發現，采用乙腈水比例固定，甲醇比例高，能縮短出峰時間，且色譜峰形尖銳、對稱，圖1～3為標準品和樣品的色譜圖。由圖1、3可看出，甲醇∶（乙腈+水）比例為20∶（78+12）時，標準品和樣品在9.6 min出峰。

2.2 衍生方式的選擇

由于黃曲霉毒素B₁具有熒光強度特性，在TLC方法中濃度較高的標準品具有較強的熒光強度，可以在紫外點樣分析儀看出，微弱的熒光強度則無法判斷且容易被雜質造成干擾。但可以用液相色譜儀檢出，需要對樣品進行衍生，用于加強黃曲霉毒素B₁的熒光強度。目前衍生的方法有柱前衍生和柱后衍生，柱前衍生法主要有三氟乙酸衍生法和鹽酸衍生法。該試驗中采用的是柱前衍生方法，對衍生劑的用量，衍生時間、衍生溫度做了考察，結果在衍生劑200 μl，50 ℃，衍生5 min條件下，可取得較好的重現性和準確度。

2.3 重復性試驗

準確稱取植物油樣品1（大豆油1），分別按照“1.2”

試驗方法進行提取衍生，再進行液相色譜分析。對黃曲霉毒素B₁峰面積的重現性進行分析，結果峰面積的RSD（n=6）為2.34%，表明該方法的重復性較好。

2.4 精密度試驗

精密吸取標準品溶液10 μl，重復進樣6次，在相同色譜條件下分析其峰面積。結果峰面積的RSD為1.38%，表明該方法的精密度良好。

2.5 回收率試驗 對未檢出的植物油加入標準品后，測定黃曲霉毒素B₁含量并計算加標回收率，結果見表1。

2.6 6種植物油中黃曲霉毒素B₁含量的檢測 供試6種植物油經提取、濃縮、衍生之后，檢測結果如下：大豆油1、大豆油2、花生調和油1、花生油1、花生調和油2、花生油2中的黃曲霉毒素B₁含量依次為0.02、0.34、1.46、5.49、2.34、4.89 μg/kg。

3 結論

該試驗建立了一種測定植物油中黃曲霉毒素B₁的分析方法，樣品經提取、濃縮、衍生，結果可靠，干擾因素小，減少了薄層層析法中用肉眼來判斷而帶來的誤差，方法準確度較高、專屬性較強，可為植物油中黃曲霉毒素的監管提供技術支持。

參考文獻

[1]IARC-WHO.Some naturally occurring substances：Food items and constituents， heterocyclic aromatic amines，and mycotoxins. IARC monograps on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans[J].Lyon France，1993，56：245-362.

[2] 柳潔，何壁英.高效液相色譜法測定食品中黃曲霉毒素的方法研究[J].現代預防醫學，2002，29（2）：137-140.

[3] 劉冬兒.酶聯免疫吸附分析法測定食品中的黃曲霉毒素B₁[J].包裝與機械，2002，23（10）：78-89.

[4] 祝偉霞，楊冀州，袁萍，等.高效液相色譜法測定3種植物油中4種黃曲霉毒素含量[J].理化檢驗-化學分冊，2013，49（8）：981-984.

[5] 柳其芳.酶聯免疫吸附法和薄層色譜法聯合分析黃曲霉毒素B₁的研究[J].中國熱帶醫學，2006，6（2）：246-248.