抗生素藥敏試驗國際標準比較

李璐璐 駱延波 胡明等

中圖分類號：S859.79+6 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2014）09-0020-04

藥敏試驗是藥理學研究與應用的重要環節，其標準化對于不同試驗者比較結果、指導臨床治療以及流行病學調查都至關重要。本文概括了藥敏試驗制定的原理和方法，并著重比較了臨床與實驗室標準協會（CLSI，前身為NCCLS，www. clsi. org）和歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST，www. eucast.org）兩大機構制定的標準間差異，幫助理解和應用這些國際藥敏試驗標準。

1 藥敏試驗標準制定的原理和方法

藥敏試驗有兩重目標，一是作為抗藥性流行病學調查的基礎數據，二是外推到體內殺菌效果，以指導臨床治療。目前主要通過標準化的藥敏試驗來測定最小抑菌濃度（MIC）或抑菌圈直徑，再根據各大機構制定的折點（breakpiont）判定標準確定測定的菌株歸類為敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）。依據試驗方法的不同，藥敏試驗結果通?？梢杂脻舛龋╩g/L或μg/ml）或抑菌圈直徑（mm）來表示。

制定一個合適的折點，至少需要以下四方面的資料：①MIC分布和野生型截點（cutoff）數值；②體外的抗藥性標志，包括抗藥表型和基因型；③動物模型和研究中的PK/PD數據；④合適的臨床研究和這些研究中可能引起感染的致病菌的MICs的臨床和細菌學數據[1]。當制定抑菌圈直徑的折點時，需要使用額外的方法（error-rate-bounded方法）來確定抑菌圈直徑與MIC之間的關系。

首先，體外用肉湯或瓊脂稀釋法測定抗生素對病原菌的MIC分布。在選取病原菌的分離菌株時，應盡可能選擇來源廣泛的菌株，這里的來源不僅指區域，還包括動物種類（健康或患病、禽源或豬源等）。在獲得MIC數據之后，一般采用繪制直方圖的方法，一方面區分野生型菌株和臨床型菌株；另一方面可以直觀的確定野生型菌株的截點數值。這里的野生型菌株一般是指對特定的抗生素沒有獲得性或者選擇性的抗藥性機制[2]。EUCAST的網站（www.eucast.org）上有許多公開的針對特定細菌-抗生素組合的表格和直方圖可供查詢（如圖1），這些數據來源于不同國家，采用特定方法進行試驗。

在確定細菌中某種抗藥性機制存在與否時，經常采用表型測定或基因型測定的方法。CLSI中規定了許多既成的表型測定方法，如苯唑西林、萬古霉素等的藥物平板篩選試驗、高水平氨基糖苷類的篩選試驗、產β-內酰胺酶的檢測方法、克林霉素的誘導性試驗等?；蛐蜋z測多是對表型測定試驗的確證，并且在大多數情況下，二者是相符的。而葡萄球菌中mecA基因的檢測常常有一些例外。對于金黃色葡萄球菌，當苯唑西林的MIC≥2mg/L時，菌株通常會攜帶mecA基因；而對于凝固酶陰性葡萄球菌，當苯唑西林的MIC≥0.5mg/L時，菌株通常會攜帶mecA基因。

要把體外測定的MIC與體內殺菌效果及療效聯系起來時，就需要考慮藥物毒理學和藥物代謝動力學，在毒理學確定的安全使用范圍內設定抗生素的給藥濃度和方案，測定體液中藥物濃度曲線及PK參數Cmax、AUC、T>MIC，確定PK模型；一般來說，血流感染被認為是最常見的復雜感染類型，因此血中藥物的PK參數被用于設定折點。同時，針對一定MIC的菌株感染的動物按照同樣劑量治療，計算PK/PD參數：AUC/MIC、Cmax/MIC、T>MIC，如圖2所示：

T>MIC：指給藥后，血藥濃度高于MIC的持續時間。通常以占一個給藥區間的百分比表示。

Cmax/MIC：抗菌藥物血藥峰濃度和MIC的比值。

AUIC：指血藥濃度-時間曲線圖中，MIC以上的AUC部分，一般以24h的AUC與MIC的比值AUC/MIC表示。

在PK穩定，給藥劑量固定的情況下，療效就與MIC呈現較強相關性，據此確定折點--S-I-R：

在上述參數之外，還要考慮藥物的另外兩個特征：藥物屬于時間依賴型藥物或濃度依賴型藥物，藥物的抗菌后效應（PAE）。

此外，還需進行一系列的臨床試驗證明MIC與治療療效之間的關系。但是由于獸醫臨床上，動物發病常常是混合型感染居多，單一致病菌引起發病的案例較少，因此制約了臨床試驗的進行。由于臨床治療的病例數量限制，上述數據達不到統計的要求，通過蒙特卡洛模擬可以極大地擴充數據，得到更準確的給藥劑量和相關性[3，4]，PK/PD參數達到一定范圍才能保證治愈的療效，見表1。

2 EUCAST與CLSI藥敏試驗標準的主要差異

2.1 歷史與普及性 成立于1967年的NCCLS（現為CLSI），自1993年版引進中國后，每版的修訂都有專家翻譯介紹，其標準引進歷史長，修訂及時，與臨床結合密切，并成為中國衛生部所頒布的標準，與WHONET結合建立世界范圍的監測網絡，在國內衛生界普遍接受。CLSI也有獸醫病原菌藥敏試驗標準，配套翻譯引進，自成體系，容易融合。而EUCAST創建于1997年，2002年統一歐洲標準，國內對其研究和應用較少，但EUCAST 的專家規則（Expert rules）和流行病學截點可以借鑒，作為CLSI的補充。

2.2 原理與文件形式 CLSI將MIC分布、PK/PD參數和臨床療效密切結合起來，按照三者關系確定折點[5]，其主要文件是標準化藥敏試驗的準則和規程、獸醫病原菌抑菌圈直徑和MIC的折點值解釋標準；而EUCAST在制定折點時，除考慮MIC分布、PK/PD參數及臨床療效外，還考慮藥物在體外的特征[6]，EUCAST制定了完整的專家規則，注明天然抗藥性、例外的抗藥性表型（可能新的抗藥性機制），對每組抗菌藥物與病原菌的藥敏試驗結果的解釋。

CLSI不注重MIC分布，注重MIC與療效的關系，根據抗藥性的發展、新機制和臨床治療實際情況，實用性強。而EUCAST除了歐盟自己測定的野生菌株MIC以外，還引用了大量文獻數據，通過直方圖可以直觀地顯示出幾千甚至上萬株野生型菌株的MIC分布，是抗藥性流行病學非常重要的技術資料，彌足珍貴。

2.3 折點值 CLSI文件中，僅規定運用折點來區分敏感、中介與耐藥，而EUCAST則在此基礎上，提出流行病學截點的定義，以與臨床型折點值予以區分。歐盟組織認為臨床實驗室應該每天使用臨床型折點值以對病人的治療提供有價值的建議，而流行病學cut-off數值則是醫院和社區的抗藥性發展過程中最為敏感的測量數據，可以用于衡量預防干預的效果，以及作為策略來對抗未來的抗藥性的發展。由于流行病學截點常常是基于MIC的分布而獲得，與劑量無關，因此這個數值往往低于臨床型折點值，見表2。如腸桿菌對各種抗生素的折點，顯著低于CLSI標準。此外，EUCAST還在文件的最后注明每種藥物的PK/PD折點值。

2.4 藥敏試驗操作規程細節的差異 培養基的選擇：CLSI和EUCAST對于常規細菌均選用MH瓊脂（MHA）和MH肉湯（MHB）進行稀釋法和擴散法的試驗，但對于一些不易培養的特殊菌群，EUCAST均采用MHF瓊脂/肉湯（MH瓊脂/肉湯+5%脫纖維馬血+20mg/L β-NAD）進行藥敏試驗，而CLSI則進行了更進一步的細化。如睡眠嗜血桿菌與胸膜肺炎放線桿菌選用巧克力瓊脂，鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌與空腸彎曲桿菌選擇添加5%脫纖維羊血的MHA，李斯特菌選用添加2%～5%的脫纖維羊血的MHB。

接種物制備：CLSI和EUCAST規定的接種物均需符合0.5麥氏濁度的標準，但CLSI規定可采用生長法或菌懸液制備法制備接種物，而EUCAST則推薦菌懸液制備法。此外，EUCAST文件中，當使用血平板孵育鏈球菌時，麥氏濁度仍然應符合0.5麥氏濁度標準，而當采用巧克力平板孵育鏈球菌時，麥氏濁度應符合1.0麥氏濁度標準。

質控菌株的選擇：CLSI推薦的質控菌株均為美國微生物保藏中心所收藏的ATCC菌株；而EUCAST除包括上述菌株外，還可使用來自于其他國家保藏中心的菌株作為質控菌株。

孵育時間：CLSI中，常規易培養細菌的孵育時間一般為16～20h，但也對一些難培養細菌進行了其他規定：如豬葡萄球菌、巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌為18～24h，睡眠嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌與李斯特菌為20～24h，空腸彎曲桿菌條件更為特殊，36～37℃孵育48h或者42℃孵育24h；而EUCAST中，除空腸彎曲桿菌42℃孵育24h以及腸球菌對糖肽類的藥敏試驗需孵育24h外，其余細菌均需孵育18～20h。

3 藥敏試驗標準的發展趨勢

隨著藥理學研究深入和臨床用藥的擴展，抗藥性也會變化，藥敏試驗標準必然有所發展：

3.1 進行藥敏試驗的最終目的是控制抗藥性，為臨床治療服務?？刂瓶顾幮允巧鷳B學、藥品管理政策、醫療成本、醫藥產業和人畜健康的權衡，嚴苛的抗生素管理，必然降低抗藥性，但人畜健康難以保障；寬松的管理政策，則造成抗藥性水平提高和流行，醫療成本增加。同時，不同區域用藥劑量和習慣不同，因此藥敏試驗標準的統一還有一個較長的較困難的路要走。

3.2 隨著抗藥性機制研究的深入和新機制的產生、發現，需要修改標準。例如，2010年1月CLSI修改M100-S20，降低頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松和氨曲南對腸桿菌科菌的折點，并在折點后增加了對應的用藥方案，更好地反映抗菌藥物在以目前推薦方案治療由菌株引起的感染時的真實療效[7]。

現在，更新的工具/數據被用于建立折點，如利用蒙特卡洛擬合法進行的藥物代謝/藥效學研究，修訂的折點將能更好地檢測攜帶不同耐藥機制的菌株，菌株的MIC與臨床預后的相關性強于菌株攜帶的耐藥機制。新的折點將為病人治療提供更合理的信息并降低臨床實驗室工作的不確定度和工作量。另外，靜脈用頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢替坦和頭孢西丁對腸桿菌科菌的折點也被重新評估但并沒有修改，因為PK-PD評估、臨床試驗、數據回顧和抗藥性機制等研究支持現有的折點。

3.3 新的藥理學觀念可能徹底改變藥敏試驗方法和標準。目前藥敏試驗方法是嚴格限定所有條件，僅測定抗生素濃度變化對殺菌力和臨床療效的影響，這顯然是不全面的，殺菌過程至少涉及病原菌數量和敏感性、藥物在體內濃度變化以及藥物作用時間，目前PK/PD參數依然是經驗值，缺乏合理的邏輯關系。除了EUCAST野生菌株MIC分布保留和擴充，以監測抗藥性流行病學外，包含病原菌數量、藥物濃度和作用時間的新的藥理學模型將會改變藥敏試驗方法和給藥模式。

3.4 兼顧人畜藥理學以及藥敏試驗方法、標準的廣泛培訓和應用，將使藥敏試驗更實用，抗藥性控制更有效。

隨著不斷變化的耐藥機制和細菌菌群分布以及人們對臨床反應藥理學因素的認識不斷加深，針對不同的感染類型、人群和給藥模式，折點將會更加合理化。

在綜合考慮不同地區用藥劑量和方案差異后，統一不同的折點將是未來的目標。

參考文獻：

[1] Turnidge J，Paterson DL.Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints [J].Clin Microbiol Rev，2007，20（3）：391-408.

[2] Dalhoff A， Ambrose PG， Mouton JW. A long journey from minimum inhibitory concentration testing to clinically predictive breakpoints： deterministic and probabilistic approaches in deriving breakpoints[J].Infection，2009，37（4）：296-305.

[3] 葉龍強，蔡挺.蒙特卡羅藥動/藥效學模型在優化抗菌藥物給藥方案中的應用[J].現代實用醫學，2009，21（1）：5-6.

[4] 楊帆，劉志昌，丁煥中，等.蒙特卡羅模擬法在抗微生物藥物藥動學和藥效學研究中的應用[J].動物醫學進展，2009，30（7）：83-87.

[5] Clinical and Laboratory Standards Institute. Development of in vitro susceptibility testing criteria and quality control parameters： approved guideline-2nd ed. CLSI document M23-A2[M].CLSI，Wayne，PA.2001.

[6] European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing （EUCAST） of the European Society of Clinical Microbiology and Infection Disease （ESCMID）.Determination of antimicrobial susceptibility test breakpoints[J].Clin Microbiol Infect， 2000， 6： 570-572.

[7] 楊啟文，朱任媛，王輝.藥敏試驗折點的設定及對臨床的指導意義[J].內科急危重癥雜癥，2010，16（4）：181-184.□