茄科蔬菜輪作對高發枯萎病蕉園土壤可培養微生物的影響

趙娜等

摘 要 采用盆栽試驗結合傳統的土壤微生物多樣性研究方法，探討了不同茄科蔬菜輪作對高發枯萎病蕉園土壤中可培養細菌、放線菌、真菌和尖孢鐮刀菌數量的影響。結果表明：香蕉連作后，土壤中真菌和尖孢鐮刀菌數量顯著增加，分別為連作前的16.53和1.92倍；與香蕉連作相比，辣椒和茄子輪作后，土壤中細菌數量分別顯著增加了5.02和2.82倍，真菌分別顯著降低了96.31%和98.42%，尖孢鐮刀菌數量分別顯著降低了87.84%和81.36%，但對放線菌數量的變化影響不顯著；與香蕉連作相比，辣椒和茄子輪作顯著提高了土壤中的放線菌/真菌[Actinomycetes/fungi（A/F）]和細菌/真菌[Bacteria/fungi（B/F）]值，且均顯著增加了土壤中具有拮抗香蕉枯萎病病原菌功能的芽孢桿菌和假單胞菌的數量。

關鍵詞 枯萎病；連作；輪作；茄科蔬菜；尖孢鐮刀菌

中圖分類號 Q939.96 文獻標識碼 A

Effects of Different Solanaceae Crop Rotations on

the Soil Culturable Microbes in an Orchard with

Serious Fusarium wilt Disease

ZHAO Na1，LI Rong2，XIN Kan1，ZHAO Yan1，RUAN Yunze1*，FU Changming1*

1 Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China

2 Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095，China

Abstract A pot experiment was performed to investigate the effect of crop rotation with different Solanaceae cultivars on the number of culturable rhizosphere bacteria，actinomycetes，fungi and Fusarium oxysporum in the soil collected from an orchard with serious fusarium wilt disease. Results showed that after banana continuous cropping the number of culturable rhizosphere F. oxysporum and fungi significantly increased，the values of which at the end of the pot experiment was 16.53 and 1.92 times compared to before planting. After crop rotation with pepper and eggplant，compared to before planting， the number of culturable rhizosphere bacteria increased by 5.02 and 2.82 times， while the number significantly decreased by 96.31% and 98.42% for fungi and by 87.84% and 81.36% for F. oxysporum，respectively，however，no significant difference of the number of actinomycetes was observed. Compared with banana continuous cropping，crop rotation with pepper and eggplant significantly improved the soil Actylomyces/Fungi and Bacteria/Fungi values，and increased the number of antagonistic Pseudomonas and Bacillus species.

Key words Fusarium wilt；Continuous cropping；Crop rotation；Solanaceae vegetables；Fusarium oxysporum

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.003

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型[Fusarium oxysporum f. sp. cubense（E. F. Smith） Snyder and Hansen（FOC）]侵染引起的土傳維管束病害[1]，近年來在中國香蕉主產區持續暴發并不斷擴大，造成巨大的經濟損失，嚴重威脅了中國香蕉產業的可持續健康發展[2-3]。由于氣候條件的限制，中國可種植香蕉的耕地面積原本就小，若再不采取有效的防治措施，中國香蕉產業將面臨嚴峻形勢[4]。

輪作能夠為農業生產帶來許多優點和多重功能，能夠保存、維持和補充土壤資源，包括有機質、養分及其他的物理化學特性[5-6]。目前已有大量關于適宜作物通過與病原菌非寄主植物的輪作而顯著降低土壤中的病原菌數量[7]、克服連作生物障礙的報道[8]。Peters等[9]研究證明大麥、紅三葉草與土豆輪作3年后，土豆根莖潰腐病和黑腐病的發病率顯著低于大麥、土豆2年輪作區域。Subbarao等[10]通過甘藍和西蘭花的輪作，降低了連作草莓土壤中病原菌的數量，抑制了黃萎病的發生。油菜和小麥輪作能夠很好地降低小麥全蝕病的發病率[11]。Larkin等[12]采用不同綠肥與土豆進行輪作，均能降低土豆不同連作土傳病害的發病率。但目前關于不同輪作體系對香蕉連作障礙影響的研究較少，有研究者嘗試用韭菜輪作防控香蕉枯萎病[13-15]，取得了一定的效果。但隨著中國香蕉種植面積日益擴大，連作障礙越發嚴重，僅僅依靠1～2種作物來維持香蕉輪作體系，遠遠不能解決問題。開發出更多的解決香蕉連作障礙的有效輪作體系，闡明不同有效輪作體系、重建香蕉根際健康的土壤微生物區系及防控香蕉連作生物障礙的機制，是確保中國香蕉產業可持續發展的重要支撐。

本研究利用平板分離培養技術，研究了香蕉在不同輪作模式下根際土壤中細菌、放線菌、真菌、尖孢鐮刀菌、芽孢桿菌、假單胞菌的群落多樣性，旨在分析不同輪作模式對土壤可培養微生物群落結構多樣性的影響，以期為克服香蕉連作障礙、實現農田的可持續發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌 供試香蕉枯萎病病原菌由南京農業大學提供。

1.1.2 土壤 為海相沉積物發育的燥紅土，采自海南萬鐘公司萬畝蕉園連作香蕉15 a的地塊（東經108°46′，北緯18°39′），基本性質為：有機質 5.09 g/kg，堿解氮 25.20 g/kg，速效磷 39.75 mg/kg，速效鉀140.00 mg/kg，pH 7.0。

1.1.3 香蕉品種 為‘農科1號（中感香牙蕉品種），由海南萬鐘實業有限公司提供。

1.1.4 辣椒 為瓊辣2號，由海南省農業科學院蔬菜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗設計 盆栽試驗于2012年7月21日至2012年10月20日（共90 d）在海南省樂東縣香蕉枯萎病研究所實驗大棚內進行，設3個處理：（1）連作土壤輪作辣椒；（2）連作土壤輪作茄子；（3）連作土壤輪作番茄，同時設立香蕉連作為對照。每個處理分3個區組，每區組10次重復。待辣椒、茄子和番茄幼苗長至2葉1心期，選擇長勢一致的幼苗連同營養缽中的蛭石一起移至盆缽中，每盆裝載5 kg 病原土，按3%（W/W）的比例施加牛糞作為底肥，每盆缽移栽2棵幼苗。當香蕉幼苗長至4～5片真葉時，選擇長勢一致的幼苗連同營養缽中的蛭石一起移至上述盆缽中，每個盆缽移栽一棵幼苗。采用常規水肥管理。

移苗后每隔30 d采集土壤樣品，每個處理的每個區組隨機取作物3株，每處理共取9株作物為3個混合土樣，于4 ℃下保存備用。

1.2.2 土壤微生物測定 土壤可培養微生物的數量通過平板稀釋涂布法測定[16]。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養；真菌采用馬丁氏培養基；放線菌采用改良的高氏一號培養基；尖孢鐮刀菌采用K2培養基；芽孢桿菌采用牛肉膏蛋白胨培養基，涂布前將土壤懸液置于80 ℃水浴鍋中加熱30 min；假單孢菌采用PSA培養基[15]。

1.2.3 具拮抗能力假單胞菌、芽孢桿菌數量的測定 采用平板對峙培養法計數對香蕉枯萎病病原菌具拮抗能力的假單胞菌和芽孢桿菌。用5 mm的打孔器從已活化的病原菌菌落前沿取圓形菌絲塊，用接種針將其接種至PDA平板中央，于28 ℃下黑暗培養1 d。待測拮抗菌選自同一梯度涂布的平板，用滅菌牙簽從平板的一側隨機挑取待測假單胞菌和芽孢桿菌各100株，等距離（2 cm）按對角線法接于病原菌菌餅周圍，每平板接種4株，以不接種待測菌為對照，每處理3次重復，分別于培養箱中以 30 ℃培養 4 d 后觀察記錄抑菌圈的有無及抑菌圈直徑。挑選有抑制效果的菌株經平板畫線純化保存，計算抑菌率[17]。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.3 數據分析

數據統計分析使用Excel 2007和SAS 9.0軟件，通過Duncan新復極差法檢驗處理間差異的顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 連作與輪作土壤中尖孢鐮刀菌數量的變化

香蕉連作中，尖孢鐮刀菌的數量除60 d時略有下降外，大體上隨移栽時間的延長而呈上升趨勢，移栽90 d時尖孢鐮刀菌數量最大，達到 6.33×104 cfu/g 干土；辣椒和茄子輪作處理中，尖孢鐮刀菌的數量隨移栽時間的延長呈現下降趨勢，移栽30 d時2處理土壤中尖孢鐮刀菌的數量差異達到顯著水平，移栽90 d時數量均達到最低，分別為0.77×104 cfu/g和1.18×104 cfu/g 干土，且兩者間無顯著性差異，但均顯著低于香蕉連作，分別降低了87.84%和81.36%，表明辣椒和茄子的輪作均能夠更有效地降低高發病土壤中尖孢鐮刀菌數量；而番茄處理中，隨著移栽時間的增加，其根際土壤中尖孢鐮刀菌數量變化趨勢與對照一致，呈現呈上升的趨勢，且始終顯著高于對照土壤中尖孢鐮刀菌的數量，90 d時番茄輪作土壤中尖孢鐮刀菌的數量達到8.34×104 cfu/g（圖1）。

2.2 連作與輪作土壤中細菌數量的變化

香蕉連作土壤中可培養細菌的數量呈現先增加后減少的趨勢，移栽30 d時數量達到最大（11.7×106 cfu/g干土），90 d時數量又降為5.03×106 cfu/g干土；辣椒和茄子輪作處理中，隨著移栽天數的增加，土壤中細菌的數量呈現不斷增長的趨勢，移栽90 d時細菌的數量達到最高，分別為30.3×106、19.2×106 cfu/g干土，顯著高于香蕉連作，分別為香蕉的6.02和3.82倍；而番茄輪作土壤中細菌的數量在移栽30 d時達到最高值即9.54×106 cfu/g干土，90 d時數量又降為4.46×106 cfu/g干土，顯著低于辣椒和茄子輪作處理，但與香蕉連作無顯著性差異（圖2）。結果表明，與對照和番茄輪作相比，茄子和辣椒的輪作均能夠更有效地增加根際土壤可培養細菌的數量。

2.3 連作與輪作土壤中放線菌數量的變化

香蕉連作土壤中放線菌數量呈上升趨勢，90 d時數量達到最大，為9.78×105 cfu/g干土，顯著高于其他蔬菜輪作處理。辣椒、茄子和番茄輪作處理中，放線菌數量的變化呈現無規律波動（圖3）。

2.4 連作與輪作土壤中真菌數量的變化

隨著香蕉連作時間的增加，真菌的數量與尖孢鐮刀菌數量變化趨勢一致，大體上呈現出增加的趨勢，在移栽60 d至90 d之間，數量增長了6.3倍，達到79.2×104 cfu/g干土，顯著高于其他蔬菜輪作處理；辣椒輪作處理中，真菌數量相對穩定，移栽90 d時數量為2.92×104 cfu/g干土；茄子輪作處理中，隨著移栽時間的增加，土壤中真菌的數量不斷降低，移栽90 d時數量為1.25×104 cfu/g干土，低于其他輪作處理，但與辣椒輪作差異不顯著；番茄輪作土壤中真菌數量呈現出增加的趨勢，90 d時達到10.9×104 cfu/g干土，顯著高于辣椒、茄子輪作處理。結果表明，與對照和番茄輪作相比，茄子和辣椒的輪作均能夠更有效地降低根際土壤可培養真菌的數量（圖4）。

2.5 不同蔬菜輪作對土壤Actinomycetes/fungi（A/F）和Bacteria/fungi（B/F）的影響

由表1可知，香蕉連作、番茄輪作均導致土壤A/F值下降，在移栽90 d后分別下降到1.24和1.11；辣椒和茄子輪作均使土壤中的A/F值大幅度升高，90 d時，顯著高于香蕉和番茄輪作處理，數量值分別為10.69和26.84。香蕉連作和番茄輪作同樣降低了土壤的B/F值，移栽90 d后，分別為6.35和40.79；辣椒和茄子輪作均增加了土壤的B/F值，其中茄子輪作土壤中B/F值升高幅度最大，是種植前的11.38倍，該2種作物輪作90 d后的B/F值分別為香蕉和番茄輪作的164.92、25.67倍與243.59、37.92倍。

2.6 不同蔬菜輪作對土壤中具拮抗能力的假單胞菌和芽孢桿菌數量的影響

平板分離得到的假單胞菌和芽孢桿菌在實驗室條件下，部分菌株對香蕉枯萎病病原菌的生長均有不同程度的抑制作用（表2），平均抑菌率因輪作作物的不同而達到顯著差異水平。辣椒和茄子輪作土壤中具有拮抗能力的芽孢桿菌和假單胞菌的平均抑制率均顯著高于香蕉連作和番茄輪作土壤；從拮抗比率分析得知，輪作辣椒和茄子土壤中的具有拮抗性的芽孢桿菌和假單胞菌的數量分別是香蕉連作土壤中的6.3和11.0倍與5.0和6.0倍。實驗結果表明辣椒和茄子輪作能夠顯著增加土壤中具拮抗能力的芽孢桿菌和假單胞菌的數量。

3 討論與結論

土壤微生物區系在土壤的養分和物質循環、形成和發育、肥力維持與提高等過程中起著重要的作用，不僅能較早地預測土壤質量的變化，還決定著土壤的質量。連作障礙發生主要與土壤傳染性病害、土壤理化性狀劣變以及由根系分泌物和殘茬分解物等引起的自毒作用等有關，而這些因子均與土壤中的微生物有一定關聯[18-21]。吳宏亮等[22]針對砂田西瓜連作障礙現狀進行定位試驗，通過西瓜與花豆、辣椒、南瓜輪作發現，這3種輪作模式均可改善土壤微生物區系結構，增加細菌、放線菌數量；劉新晶等[23]研究發現麥-米-豆輪作土壤中氨氧化細菌、好氣性自生固氮菌和好氣性纖維素分解菌等生理菌群的數量顯著高于大豆15年連作。本研究結果與前人結果一致，隨著香蕉連作時間的增加，土壤中可培養細菌菌群數量不斷下降，且連作時間越長下降幅度越大；辣椒、茄子輪作則增加了土壤中可培養細菌的數量。香蕉連作土壤中放線菌數量則隨移栽時間的增加而增加，這與尹睿等[24]研究蔬菜地連作時發現土壤中微生物區系產生了極大的變化而放線菌數量卻顯著增加的結論一致。辣椒、茄子輪作對放線菌的數量沒有顯著影響，這與閆志山等[25]關于甜菜輪作和吳宏亮等[22]的研究結論（輪作有助于土壤中放線菌數量增加）相違，具體原因仍需進一步研究。

植物的病原菌中70%為真菌，故土壤中真菌數量增加及其所占比例提高是土壤退化、致病性提高的標志[26-27]。本實驗結果表明，真菌菌群密度在香蕉連作土壤中大幅增加，尤其是尖孢鐮刀菌的數量增加極其顯著，表明選擇性富集于此土壤微環境中的尖孢鐮刀菌類群開始形成優勢菌群并對其他種群產生抑制作用，導致真菌多樣性水平降低，與不同蔬菜輪作相比差異達到顯著水平。辣椒輪作在一定程度上減少了土壤中真菌的數量，尤其對降低與香蕉枯萎病相關的尖孢鐮刀菌的數量效果顯著，這一結論與于高波等[28]初步認為輪作處理減少了結瓜后期的根際土壤真菌種類的結論相一致。

細菌在生物防治中起著重要的作用，包括熒光假單孢菌、假單孢桿菌、芽孢桿菌和鏈霉菌等。本研究中的假單胞菌和芽孢桿菌平板對峙實驗結果表明，連作土壤中具有拮抗香蕉枯萎病病原菌能力的拮抗菌數量顯著低于輪作土壤，輪作平均抑菌率與連作達到顯著性差異。初步推斷輪作增加了土壤中有益微生物的數量，增強了土壤抵御病原菌的能力。

土壤中細菌和真菌的比值（B/F）與放線菌和真菌的比值（A/F）是土壤微生物區系結構中重要的特征指標。有研究表明，土壤中真菌數量增加而導致A/F和B/F 比值減小，將不利于作物的生長，是土壤土傳病害增加的可能原因之一[29]。本研究中，隨移栽時間的增加，香蕉連作土壤真菌數量呈現增加的趨勢，導致A/F值降低，隨著細菌數量的降低，真菌數量的增加，B/F值也在下降。而辣椒、茄子輪作土壤中真菌數量隨著種植時間的增加而不斷降低，且放線菌數量也略有升高，細菌數量顯著提高，與香蕉連作相比能極顯著地提高土壤中的A/F和B/F值，而番茄輪作則截然相反，辣椒、茄子輪作和香蕉連作相比差異達顯著水平。

盆栽試驗研究結果表明，辣椒和茄子輪作與香蕉連作相比能夠顯著降低根際土壤中尖孢鐮刀菌和真菌的數量，同時顯著增加了土壤中可培養的細菌、放線菌的數量，從而提高了土壤中A/F和B/F的比值，改善了土壤微生物區系失衡現象；輪作也使土壤中有拮抗功能的有益芽孢桿菌和假單胞菌的數量顯著增加，可能有利于克服香蕉的連作障礙，但具體效果需要田間試驗的進一步研究驗證。

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