水稻OsPIN1a基因體外表達及蛋白磷酸化活性位點分析

王尉等

摘 要 輸出載體OsPIN1a是水稻PIN-FORMED（PIN）的家族成員之一，參與調節生長素在植物組織中的不均衡分布。然而，OsPIN1a蛋白的功能結構域如何調節激素的極性運輸仍需進一步探討。本研究擬以日本晴水稻為材料，利用OsPIN1a基因的非編碼區設計引物，特異地克隆目的基因，并借助Quickchange XL site-directed mutagenesis技術分別構建單突變[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala）和pET30-OsPIN1a（Ser254/Ala）]及雙突變[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala和Ser254/Ala）]表達載體，通過體外蛋白表達和磷酸化活性分析，明確了OsPIN1a蛋白水解結構域中Ser-233和Ser-254是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PINOID，PID）的磷酸化活性位點，此結果為進一步研究生長素的極性運輸機制提供參考。

關鍵詞 水稻；OsPIN1a；蛋白表達；磷酸化

中圖分類號 S511；Q78 文獻標識碼 A

Expression in vitro of OsPIN1a Gene and

Analysis of Phosphorylation Sites

WANG Wei1，2， GUO Ning1， XU Mingzhao1， TIAN Haiyan2， SHI Shengyou2*

1 School of Life Sciences， Anhui Agricultural University， Hefei，Anhui 230036， China

2 South Subtropical Crop Research Institute， Chinese Academy of Tropical

Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract As one of PIN-FORMED（PIN）efflux carriers， OsPIN1a is involved in regulating auxin distributions in plant tissues. However， how these functional sites of OsPIN1a regulate hormone distribution still need to be further analyzed. In our study， OsPIN1a gene was isolated from Oryza sativa L. cv. Nipponbare using the specific primers， designed according to untranslated regions. To explore the phosphorylation sites of OsPIN1a in proteolytic structures， the expression vectors of single mutation[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala） and pET30-OsPIN1a（Ser254/Ala）]and double mutation[pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala and Ser254/Ala）]were constructed by quickchange XL site-directed mutagenesis technique， respectively. OsPIN1a was expressed and analyzed by the expression system in vitro. Two phosphorylation sites of Ser-233 and Ser-254 can be phosphorylated by a serine-threonine protein kinase（PINOID， PID）. The results provide a reference for further studying the mechanism of auxin polar transport.

Key words Rice；OsPIN1a；Protein expression；Phosphorylation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.014

高等植物的生長發育受到植物激素的精確調控。生長素在莖尖、幼葉和根等組織器官中合成后，通過輸出載體（PIN-FORMED，PIN）、輸入載體（AUXIN RESISTANT1/LIKE AUX1，AUX1/LAX）及轉運蛋白（P-GLYCOPROTEIN，PGP/ABCB）極性運輸到植株的不同部位[1-5]，不僅參與了植物的生理代謝過程，而且與根的向光性密切相關[6-7]。

擬南芥AtPIN家族包含8個PIN基因，AtPIN1、2、3、4、7屬于膜蛋白，而AtPIN5、6、8位于內質網上，這些蛋白可與AUX1及轉運蛋白協同作用調節生長素的極性運輸，導致激素在組織中的不均衡分布，影響根的伸長和向地性等特性[8-9]。在水稻中，至少存在12個編碼OsPIN家族基因（OsPIN1a-d、2、5a-c、 8、 9、 10a-b）， 分別位于不同的染色體上[4]。OsPIN蛋白包含兩個疏水區（功能結構域）和一個親水區，且每個疏水區有5次跨膜折疊[10]。然而，多基因家族的單個基因突變并不易引起植物形態的改變或功能的缺陷，尤其是水稻的OsPIN1包括a、b、c、d 等4個同源蛋白，具有較高的同源性，僅有幾個氨基酸的差異性[4]。因此，特異地分離同源基因，對明確其各自的功能顯得尤為重要。

研究表明，PIN蛋白可逆的磷酸化活性對調節生長素極性運輸起著關鍵作用，而這一過程需要絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PINOID（PID）和PP2A磷酸化酶的共同參與[11]。蛋白激酶抑制劑可阻礙擬南芥AtPIN1中TPRXS（N/S）結構域磷酸化位點的活性，進而影響生長素的極性運輸[12-13]。為探討水稻OsPIN1a蛋白如何調節生長素的極性運輸，本實驗通過OsPIN1a克隆、體外蛋白表達及功能活性位點分析，明確了OsPIN1a親水區的磷酸化位點，為進一步研究生長素的極性運輸機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將在濕潤濾紙上萌發后的水稻（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）秧苗移置在光照培養箱中進行培養（30 ℃，16 h光/8 h黑暗）。兩周后，選取長勢較好的植株材料置于-70 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 水稻植株總RNA的分離與cDNA合成 用RNAiso Plus（Takara）提取水稻植株中的總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計用于檢測RNA的質量。一鏈cDNA的合成參照PrimeScript Reverse Transcriptase（TaKaRa）使用說明進行。

1.2.2 OsPIN1a引物設計及PCR擴增 根據GenBank中所報道的水稻OsPIN1a基因（GenBank登錄號為BR000827）兩端非編碼區序列設計特異引物（上游引物：GAAGTCGTGGTTTTCTTGGCTGC，

下游引物：GCAAACATGACGACCCTCACCT），以高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶（Takara）進行目的基因PCR擴增。反應體系為：cDNA模板2 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，2×GC buffer 25 μL，10 mmol/L上、下游引物各2 μL，2.5 U/μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補足至50 μL。擴增程序為：85 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環，最后72 ℃總延伸10 min。將上述PCR產物回收并連入pMD18-T載體（TaKaRa）中，通過藍白斑和酶切鑒定篩選陽性克隆，后進行測序鑒定目的片段的正確性。

1.2.3 重組質粒的構建 以pMD18-OsPIN1a為模板，分別用含有NdeI和XhoI的上下游引物特異性擴增OsPIN1a序列（上游引物：GTCATATGGTGCAGA

TCGTGGTGCTCCAGTG，下游引物：GCCTCGAGTC

ACAGCCCCAGCAGGATG TAGT），后將目的片段連入pET-30表達載體。Quickchange XL site-directed mutagenesis（Stratagene）用于OsPIN1a中Ser-233和Ser-254突變載體構建，具體操作步驟依據說明書進行。

1.2.4 重組質粒在大腸桿菌中表達及蛋白純化 將pET30-OsPIN1a、pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala）、pET30-OsPIN1a（Ser254/Ala）、pET30-OsPIN1a（Ser233/Ala，Ser254/Ala）和pET-30空載體分別轉入大腸桿菌（BL21）中。選擇單克隆在5 mL的LB液體培養基（卡那霉素，50 μg/mL），37 ℃，200 r/min培養過夜；后取2 mL菌液在400 mL LB液體培養液（卡那霉素，50 μg/mL）中放大培養至OD約為0.5，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，18 ℃誘導24 h。通過鎳柱親和層析的方法純化重組蛋白，具體步驟依據Qiagen公司的蛋白純化手冊進行。

1.2.5 Western blot和重組蛋白體外磷酸化分析 Western blot依據Welinder等[14]所描述的方法操作。帶有His標簽的PID激酶和純化的重組蛋白用于體外磷酸化分析[11，13]。將1 μg上述兩種蛋白混勻后加入ATP溶液（100 mmol/L MgCl2/ATP和1 μ Ci [γ-32P]ATP）和激酶反應混合液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L DTT和5 mmol/L MgCl2）置于30 ℃反應40 min，后煮沸5 min終止反應。10%的聚丙烯酰胺凝膠用于分離重組蛋白，蛋白膜被密封在塑料的器皿中，置于-20 ℃下曝光24～48 h。P32放射自顯影信號強度與考馬斯染色結果的比值用于表示蛋白的磷酸化活性。

2 結果與分析

2.1 OsPIN1a基因克隆及分析

依據OsPIN1a基因非編碼區序列設計特異引物，分別以水稻DNA和RNA為模板進行PCR擴增。電泳結果如圖1所示，在不同的核酸水平上均特異地擴增出一目的條帶，與Genbank中已登錄的序列大小相符。為進一步驗證所得序列的正確性，將上述PCR產物回收并連入T載體中進行測序，所得核苷酸序列與OsPIN1a（GenBank登錄號為BR000827）具有99.7%的同源性，個別堿基的差異性可能是測序或PCR擴增產生的誤差。同源比對和在線預測（NetPhos program）發現OsPIN1a-d蛋白序列中均含有擬南芥AtPIN1類似PID磷酸化的保守結構域TPRXS（N/S）。

2.2 OsPIN1a體外表達及蛋白純化

鎳柱親和層析對體外表達的OsPIN1a蛋白進行純化，結果如圖2所示，在約65 ku（含有6個組氨酸）處有一條純化的蛋白條帶。用His抗體對OsPIN1a基因表達結果進行Western blot驗證，1泳道空質粒表達的蛋白65 ku處無任何免疫信號；而pET30-OsPIN1a表達（2泳道）和純化（3泳道）的蛋白均具有較強的免疫信號。由此表明，OsPIN1a蛋白已在大腸桿菌中成功表達。

2.3 OsPIN1a蛋白PID磷酸化位點分析

將OsPIN1a的TPRXS（N/S）結構域中預測的磷酸化位點Ser-233和Ser-254分別用Ala替代，對單突變及雙突變基因進行體外表達和純化，并與PID激酶互作進行磷酸化活性分析。結果如圖3所示，泳道1中完整的OsPIN1a蛋白具有較強的磷酸化信號，當233位點的Ser突變為Ala時，放射自顯影信號明顯降低（泳道2）；類似地，254位點的Ser也可被PID激酶磷酸化（泳道3）；如將上述兩位點同時突變時，P32信號強度進一步減弱（泳道4）。

3 討論與結論

水稻OsPIN1類型的蛋白（OsPIN1a-d）具有較高的同源性，這給單基因分離和功能分析增加了困難。考慮到OsPIN1a-d組織器官表達差異性可能與基因特異的非編碼調控區相關[4-5]。至此，本研究選取OsPIN1a基因3′和5′端非編碼區設計引物特異地分離了目的基因。由于序列內部引物較難分辨不同的OsPIN1a-d基因，故用啟動子結合相應的報告基因（GUS或GFP等）研究其組織定位和基因表達特征將更優于RT-PCR。

光作為重要的環境信號影響著根的負向光性與生長素的極性運輸。王忠等[15]和Xu等[16]研究表明，水稻根負向光性與OsPIN1a調控根冠的生長素極性運輸形式密切相關。然而，OsPIN1a通過何種機制發揮運輸活性仍需進一步明確。擬南芥的AtPIN1親水性區域TPRXS（N/S）含有多個絲氨酸（如：Ser-337）和蘇氨酸（如：Thr-340）磷酸化活性位點[11，17-18]，磷酸化位點突變后的AtPIN1最終定位于根尖的表皮基部，而具有磷酸化活性的AtPIN1則位于頂部。上述結果與PID激酶缺失突變體所表現的特性是類似的[19]，這表明PID激酶可能通過調節AtPIN1的磷酸化活性，進而影響蛋白在細胞中的定位。

TPRXS（N/S）作為PIN蛋白親水性區域的保守結構域，廣泛存在于不同植物中[13]。擬南芥的PID激酶在體外可使TPRXS（N/S）結構域中的Ser磷酸化，影響AtPIN1蛋白在組織中的定位和植株的生長發育[13]。本研究對比發現水稻OsPIN1、OsPIN2和OsPIN10蛋白中均含有TPRXS（N/S）結構域，PID激酶也可使OsPIN1a蛋白保守結構域中Ser（233和254位點）發生體外磷酸化（圖3），這表明不同植物同一類型的PIN蛋白可能具有類似的磷酸化激活機制[20]。盡管水稻OsPIN1a中的233和254兩個Ser活性位點被突變，但仍具有部分磷酸化信號強度，這與AtPIN1a蛋白體外磷酸化研究結果是一致的[15]，猜測可能OsPIN1a蛋白中含有其它的PID激酶磷酸化位點。而水稻OsPIN5、OsPIN8和OsPIN9蛋白相同位點缺少類似的TPRXS（N/S）結構域，這是由于不同類型的PIN具有不同的激活機制，在調節激素運輸過程中具有不同的功能。然而，OsPIN家族不同成員之間如何協同作用調節生長素的極性運輸，仍需進一步研究。

參考文獻

[1] Parry G， Marchant A， May S， et al. Quick on the uptake： characterization of a family of plant auxin influx carriers[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2001， 20（3）： 217-225.

[2] Paponov I A， Teale W D， Trebar M， et al. The PIN auxin efflux facilitators： evolutionary and functional perspectives[J]. Trends in Plant Science， 2005， 10（4）： 170-177.

[3] Geisler M， Murphy A S. The ABC of auxin transport： the role of p-glycoproteins in plant development[J]. FEBS letters， 2006， 580（4）： 1 094-1 102.

[4] Wang J R， Hu H， Wang G H， et al. Expression of PIN genes in rice（Oryza sativa L.）： tissue specificity and regulation by hormones[J]. Molecular Plant， 2009， 2（4）： 823-831.

[5] Xu M， Zhu L， Shou H， et al. A PIN1 family gene， OsPIN1， involved in auxin-dependent adventitious root emergence and tillering in rice[J]. Plant and cell physiology， 2005， 46（10）： 1 674-1 681.

[6] Davies P J. The plant hormones： their nature， occurrence， and functions[M]. Plant hormones. Springer Netherlands， 2010： 1-15.

[7] 莫億偉， 王 忠， 錢善勤， 等. 生長素在水稻根負向光性反應中的作用[J]. 中國水稻科學， 2004， 18（3）： 245-248.

[8]Bhalerao R P， Eklof J， Ljung K， et al. Shoot-derived auxin is essential for early lateral root emergence in Arabidopsis seedlings[J]. Plant Journal， 2002， 29（3）： 325-332.

[9] Mravec J， Skupa P， Bailly A， et al. Subcellular homeostasis of phytohormone auxin is mediated by the ER-localized PIN5 transporter[J]. Nature， 2009， 459（7250）： 1 136-1 140.

[10] 丁 懿， 石彩娟， 王萬軍. 水稻PIN家族的生物信息學分析[J]. 安徽農業科學， 2012， 40（27）： 13 238-13 242.

[11] Michniewicz M， Zago M K， Abas L， et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux[J]. Cell， 2007， 130（6）： 1 044-1 056.

[12] Rashotte A M， DeLong A， Muday G K. Genetic and chemical reductions in protein phosphatase activity alter auxin transport， gravity response， and lateral root growth[J]. Plant Cell， 2001， 13（7）： 1 683-1 697.

[13] Huang F， Zago M K， Abas L， et al. Phosphorylation of conserved PIN motifs directs Arabidopsis PIN1 polarity and auxin transport[J]. Plant Cell， 2010， 22（4）： 1 129-1 142.

[14] Welinder C， Ekblad L. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis[J]. Journal of proteome research， 2011， 10（3）： 1 416-1 419.

[15] 王 忠， 莫億偉， 錢善勤， 等. 水稻根的負向光性及其影響因素[J]. 中國科學： C 輯， 2003， 33（1）： 9-18.

[16] Xu H， Mo Y， Wang W， et al. OsPIN1a gene participates in regulating the negative phototropism of rice roots[J]. Rice Science， 2014， 21（1）： 1 704-1 710.

[17] Nühse T S， Stensballe A， Jensen O N， et al. Phosphoproteomics of the Arabidopsis plasma membrane and a new phosphorylation site database[J]. Plant Cell， 2004， 16（9）： 2 394-2 405.

[18] Benschop J J， Mohammed S， OFlaherty M， et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis[J]. Molecular & Cellular Proteomics， 2007， 6（7）： 1 198-1 214.

[19] Zhang J， Nodzyński T， Pěn？ík A， et al. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2010， 107（2）： 918-922.

[20] Morita Y， Kyozuka J. Characterization of OsPID， the rice ortholog of PINOID， and its possible involvement in the control of polar auxin transport[J]. Plant and cell physiology， 2007， 48（3）： 540-549.

責任編輯：凌青根