無籽沙糖橘CrS1—1基因的克隆與表達分析

吳秀蘭 何思欣

摘 要 為研究顯花植物自交不親和的分子機理，以無籽沙糖橘為試材，克隆無籽沙糖橘花粉S1基因的cDNA和DNA全長序列，命名為CrS1-1，該基因cDNA和DNA全長均為450 bp。半定量PCR分析結果表明，該基因在花粉中特異表達。Real-time PCR分析表明，該基因在無籽沙糖橘自花授粉72h表達量達到最大，而無籽沙糖橘×有籽沙糖橘異花授粉72 h的表達量最低。

關鍵詞 無籽沙糖橘；自交不親和性；CrS1-1；表達分析

中圖分類號 S666 文獻標識碼 A

Cloning and Function Analysis of CrS1-1 Gene in

Citrus reticulata Blanco cv. Wuzishatangju

WU Xiulan*， He Sixin

College of Life Science， Zhaoqing University， Zhaoqing， Guangdong 526061， China

Abstract In this study， the full-length sequences of cDNA and DNA of CrS1-1 gene were obtained from a mandarin Wuzishatangju（Citrus reticulata Blanco）. The length of cDNA or DNA is 450 bp. Tissue-specific expression of CrS1-1 was detected using semi-quantitative RT-PCR and quantitative real-time PCR. CrS1-1 expressed exclusively in anthers. When 'Wuzishatangju' was self-pollinated， the expression level of CrS1-1 in pistils reached a maximum at 72 h， and decreased thereafter. While in cross-pollination of‘Wuzishatangju× ‘Shatangju， the expression was very weak at 72 h.

Key words Wuzishatangju； Self-incompatibility； CrS1-1； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.020

植物自交不親和性（Self-incompatibility，SI）是顯花植物為防止近親繁殖、促進異花授粉而形成的一種機制，是分子生物學的研究熱點之一。根據遺傳背景可將SI分為配子體自交不親和（Gemetophytic self-incompatibility，GSI）和孢子體自交不親和（Sporophytic self-incompatibility，SSI）。果樹自交不親和大多屬于GSI自交不親和，主要由花柱S-RNase基因和花粉F-box基因關鍵因子決定[1-6]。除了花粉和花柱關鍵因子外，還有很多非關鍵因子，如鈣結合蛋白（CaBP）[7-8]、泛素結合蛋白（actin-bing proteins）[9]、鋅指蛋白（Zinc-finger protein）[10]、HT-B[11-12]、γ-硫堇（γ-thionin，MdD1）[13]、S1 Protein等[14]可能也參與自交不親和反應。這些非關鍵因子在花粉和花柱相互識別過程中，可能起到識別和降解S-RNase、細胞信號轉導、調節花粉管生長等作用，最終由關鍵因子與非關鍵因子共同作用而導致自交不親和的發生[6，11，15-16]。Foote等[14]通過虞美人（Papaver rhoeas L.）離體及活體花粉萌發試驗，發現S1蛋白可以抑制S1基因型的花粉萌發，而不能抑制非S1基因型的花粉萌發，認為S1蛋白參與了自交不親和性反應。但在柑橘研究中，關于S1蛋白在自交不親和反應中的作用尚未見報道。本研究以無籽沙糖橘成熟花粉為試材，克隆無籽沙糖橘S1基因cDNA和DNA的全長序列，命名為CrS1-1。并分析了該基因在不同組織器官、自交及異交授粉后不同時段的表達特性， 為研究S1蛋白在自交不親和反應中的作用及柑橘選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料由華南農業大學提供，于2012年春季取無籽沙糖橘7個器官（芽、葉、花粉、花絲、柱頭、花柱、子房），以及無籽沙糖橘自交授粉、無籽沙糖橘×有籽沙糖橘異花授粉后不同時段（0、12、24、48、72、96、120、144 h）的雌蕊。所有材料液氮速凍后，于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA、基因組DNA的提取及其cDNA第一鏈的合成 基因組DNA提取采用CTAB法[17]，并略加改進。總RNA提取采用天恩澤公司的Column Plant RNAOUT試劑盒進行，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。cDNA第一鏈合成參照Life Technology公司生產的M-MLV反轉錄試劑盒進行。RNA酶抑制劑（RNase Inhibitor）及DNase I（RNase Free）購于TaKaRa公司。

1.2.2 S1基因的克隆 S1采用3′和5′RACE法克隆：根據華中農業大學甜橙基因組S1（Cs8g11080）序列，分別設計特異引物S1-3′ RACE和S1-5′ RACE（表1）。嚴格按照Clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit操作說明進行。用Agarose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）回收PCR產物，連接到pMD19-T vector（TaKaRa）克隆載體，轉化至大腸桿菌DH5α菌株，PCR檢測并酶切鑒定后送北京華大基因（BGI）公司測序。

S1基因cDNA全長克隆：利用生物軟件DNA Man將5′ RACE、3′ RACE測序結果，以及甜橙Cs8g11080序列進行拼接，并用ORF Finder（Open Reading Frame Finder）進行ORF預測。設計包含起始密碼和終止密碼的上、下游引物S1-F和S1-R（表1），對預測ORF進行驗證。以花粉cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系為10×PCR buffer 5.0 L，dNTP 1.0 L，上下游引物各0.5 L，模板cDNA 1 L，ExTaq 0.5 L，加ddH2O至總體積50 L。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。回收、轉化及測序同上。

S1基因組DNA全長的克隆：方法與擴增cDNA全長相同。

通過NCBI中BLASTx進行S1蛋白同源性搜索與比對，利用Clustal X軟件進行同源性分析，使用MEG 5軟件UPGMA法構建系統發育樹。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析 利用TOYOBO公司的7300 Real-time PCR擴增儀器進行實時定量PCR試驗，熒光染料試劑盒用SYBR Premix Ex Taq。以反轉錄得到的cDNA用于Real-time PCR分析，引物為QS1-F和QS1-R（表1）。以ACTB為內參引物（表1）。擴增體系為20 μL：SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板cDNA 20 ng，加ddH2O至20 μL。Real-time PCR擴增程：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，40 cycles，每次循環在第3步采集熒光。內參基因和待測基因均設置3次重復。

2 結果與分析

2.1 RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成

采用柱式植物RNAout（TIANDZ）提取無籽沙糖橘花器官總RNA后，取5 μL點樣于1.2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。結果見圖1。從圖1可以看出，28S RNA與點樣孔之間無明顯亮帶，說明無DNA污染；28S RNA和18S RNA條帶清晰明亮，并且5S RNA可見，說明提取的總RNA完整，無降解，適宜進行后續的cDNA第一條鏈的合成。

2.2 S1基因的克隆與序列分析

根據S1基因（Cs8g11080）序列設計的特異引物S1-3′ RACE和S1-5′ RACE，進行PCR擴增（圖2-A、B），克隆測序后分別得到486 bp的3′ 端（圖2-A），以及366 bp的5′ 端（圖2-B）序列。將克隆得到RACE序列與Cs8g11080中間序列進行拼接，得到450 bp（圖2-C），該序列含起始和終止密碼子的S1 ORF。根據拼接所得序列，設計特異引物S1-F和S1-R進行PCR擴增（圖2-D），克隆測序后獲得長度為450 bp序列（表2），經比對后，發現該序列與拼接序列相一致。通過NCBI在線比對，發現該序列與其他植物的S1基因序列具有較高的同源性，可以確定所獲得的基因為柑橘花粉S1基因家族中的一員，命名為CrS1-1。

ORF Finder分析表明，CrS1-1基因包含一個450 bp的完整開放閱讀框，編碼一個含149個氨基酸的蛋白質（表2），推定的分子量為18.13 ku，理論等電點為6.19。

2.3 CrS1-1系統進化樹分析

利用NCBI對CrS1-1氨基酸序列進行同源性比對，結果見圖3。由圖3可知，CrS1-1基因編碼的蛋白與甜橙S1蛋白（Cs8g11080）同源性最高，達到99%。其次是擬南芥S1蛋白（NM00112557），同源性為78%。

2.4 半定量與Real-time PCR表達分析

利用半定量和定量PCR對CrS1-1在無籽沙糖橘不同組織器官，以及自交和異交后不同時間段雌蕊的表達特性進行了分析。結果表明，該基因在芽、葉、花粉中均有表達，其中花粉的表達量最高，為特異性表達。在花柱、花絲、柱頭、子房中基本不表達（圖4-A）。Real-Time PCR分析結果見圖4-B，由圖4可知，該基因在花粉中表達量最高，達到10.62，而在子房中的表達量最低，僅為0.21，不同器官的表達水平排序分別為花粉>葉>花柱>柱頭>芽>花絲>子房。其結果與半定量結果基本一致。

由于CrS1-1在花粉中特異性表達，為研究該基因授粉后的表達情況，檢測了無籽沙糖橘自花授粉、無籽沙糖橘×有籽沙糖橘異交授粉后8個不同時間段的基因表達水平，Real-time PCR結果見圖5。雌蕊中無籽沙糖橘自交授粉后0 h基本不表達，12 h到24 h表達量上升，48 h到72 h迅速上升，3 d之后有迅速下降，6 d后表達量降到很低。而在無籽沙糖橘×有籽沙糖橘異交授粉后0 h到48 h呈下降表達，72 h表達量迅速下降，之后緩慢上升。

3 討論與結論

自交不親和性是顯花植物為防止近親繁殖、促進異化授粉而形成的一種機制。研究結果表明，自交不親和性反應是一個多基因協同作用的復雜過程，在模式植物中，除花柱S-RNase和花粉F-box基因（SLF/SFB）2個自交不親和反應關鍵決定因子外，還有非關鍵因子如：鈣結合蛋白、泛素、S1蛋白自交不親和蛋白等也參與其中[4，9，12]。Ye等[18]發現無籽沙糖橘的阻抑部位在子房，其表現是無籽沙糖橘自交72 h時花粉管在子房內部開始自身盤繞生長，無法接近胚珠，并且向著遠離胚珠的子房底部盤繞生長。隨后Miao等[19]對S-RNase進行了研究，發現S-RNase在無籽沙糖橘自交后72 h表達量達到最高，120 h以后迅速遞減，168 h幾乎不表達，而該基因在無籽沙糖橘異交后72 h幾乎不表達，這與細胞學上觀察到無籽沙糖橘自交后72 h出現花粉管卷曲，異交后72 h花粉管正常生長的時間相吻合。

本研究無籽沙糖橘花粉中克隆到一個自交不親和CrS1-1基因，半定量PCR結果表明，CrS1-1基因在無籽沙糖橘上具有明顯的組織器官表達特異性，與成建紅等[20]在櫻桃上報道花粉關鍵基因PaSFB9基因具有組織器官特異性表達結果一致，也與薔薇科果樹扁桃（Prunus dulcis）[21]、甜櫻桃（P. avium）[22]和蘋果（Malus×domestica）[23]等植物花粉SFB/SLF基因的表達特異性一致。Real-time PCR進一步發現該基因在花粉中表達量明顯高于其它部位，約為葉片的5倍、芽的9倍。無籽沙糖橘自交不同時段Real-time PCR分析表明，無籽沙糖橘自交后72 h表達量達到最高，96 h后迅速遞減，144 h表達量很低；無籽沙糖橘×沙糖橘異交后不同時段Real-Time表明異交后72 h表達很低。這與無籽沙糖橘S-RNase自交及異交不同時段不同組織表達結果相一致，也與細胞學上觀察到無籽沙糖橘自交后72 h出現花粉管卷曲而異交后72 h花粉管正常生長的時間相吻合[18-19]。推測CrS1-1基因參與了關鍵因子自交不親和反應，從而抑制了花粉管的正常生長導致花粉管出現卷曲，不能到達胚珠完成正常的授粉受精過程，形成無籽果實。但CrS1-1如何參與關鍵因子進行自交不親和反應仍需進一步研究。

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責任編輯：趙軍明