基于ITS2條形碼的南藥巴戟天真偽鑒別

黃瓊林等

摘 要 本研究旨在建立基于ITS2條形碼的巴戟天及其混偽品的真偽鑒別方法。采用試劑盒提取巴戟天植物樣品的總DNA，以一對通用引物對其ITS2條形碼進行PCR擴增并測序；從Genbank數據庫獲取巴戟天及其混偽品ITS2序列。采用DNAMAN、ClustalX軟件拼接比對序列，以及利用MEGA5.1軟件構建NJ樹。獲得的22條ITS2序列的長度范圍為224～244 bp，GC含量范圍為59.8%～70.1%。巴戟天與8種混偽品的ITS2序列存在155處變異，種間K2P遺傳距離遠大于種內K2P遺傳距離。基于ITS2條形碼的NJ聚類樹能直觀地區分巴戟天及其混偽品。因此，ITS2條形碼適用于南藥巴戟天及其混偽品的鑒別，可為其基原研究提供重要的分子鑒定證據。

關鍵詞 巴戟天；混偽品；ITS2條形碼；鑒別

中圖分類號 S567.239 文獻識別碼 A

Identifying Morinda officinalis and Its Adulterants

Based on ITS2 Barcode

HUANG Qionglin1， ZHENG Xiasheng2， CAI Chun1*

1 Guangdong Medical College， Zhanjiang， Guangdong 542023， China

2 Guangzhou University of Chinese medicine， Guangzhou， Guangdong 510006， China

Abstract The study aimed to establish a novel identification method for Morinda officinalis and its adulterants based on ITS2 barcode. Genomic DNA was extracted from M. officinalis leaves kept in gel and ITS2 region was amplified and sequenced with a pair of universal primers. ITS2 sequences of M. officinalis and its adulterants acquired from plant materials and Genbank were assembled and aligned by DNAMAN and CLUSTALX， and the NJ tree was constructed using MEGA 5.1. Significant differences were observed in the ITS2 sequences between M. officinalis and its adulterants. The interspecific genetic distance was far more than the intraspecific distance. NJ tree based on ITS2 sequences can distinguish M. officinalis and its adulterants intuitively. Therefore， ITS2 barcode could be used to identify M. officinalis and its adulterants effectively， and provide important molecular evidence for the authentication of germplasm resources.

Key words Morinda officinalis； Adulterants； ITS2 barcode； Identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.021

巴戟天是中國著名“四大南藥”之一，藥典收載正品來源于茜草科巴戟天屬植物巴戟天（Morinda officialis How.）的干燥肉質根，味辛甘、性溫，具有補腎助陽，祛風除濕，強筋健骨的功效，主治腎虛陽萎、遺精早泄、少腹冷痛、小便不禁、宮冷不孕、風寒濕痹、腰膝酸軟等癥[1]。由于藥食兩用的價值，巴戟天在民間和商業上均被廣泛利用和開發，但人工栽培無法滿足當前的需求。市售巴戟天藥材頻頻出現偽品，如同屬的假巴戟Morinda shuanghuaensis、雞眼藤Morinda parvifolia、羊角藤Morinda parvifolia等，這些物種的形態與巴戟天極為相似，僅靠傳統鑒定技術無法完全將其區別。這些混偽品的成分與巴戟天存在較大差異，功效不盡相同，它們的存在對巴戟天的臨床用藥造成很大的安全隱患，也制約了巴戟天產業現代化的進程。

由于傳統方法對巴戟天真偽鑒別存在不足，前人也已采用DNA序列分析進行巴戟天及其偽品的鑒別。丁平等[2]利用ITS序列對巴戟天與3個偽品（假巴戟、羊角藤和虎刺Damnacanthus indicus）進行鑒別，但是ITS序列較長，對DNA質量要求高，PCR擴增和序列分析難度較大。姬生國等[3]分析了巴戟天及樟葉巴戟Morinda cinnamomifoliata等4個偽品的psbA-trnH序列差異，但變異水平低，容易產生誤差，在一定程度上不利于更多樣品的鑒別。因此，有必要在更廣泛樣本的基礎上建立簡便準確的巴戟天真偽鑒別方法。

本文利用當前熱門的藥用植物DNA條形碼——核內第二轉錄間區（secondary internal transcribed space， ITS2）對巴戟天及其8種混偽品進行鑒別，為其臨床用藥安全和資源保護提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的ITS2序列來源于植物樣品實驗或Genbank下載（表1）。植物樣品采集于廣州中醫藥大學大學城校區藥王山，經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室童家赟講師鑒定，取其葉片置硅膠中保存備用。

植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技公司；PCR試劑、Ex Taq DNA聚合酶、DNA Markers購自大連寶生物工程公司；引物合成和測序由北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司完成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴增和測序 巴戟天葉片總DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒進行提取。利用ITS2條形碼特異性引物（上游：5′-ATGCGAT

ACTTGGTGTGAAT-3′；下游：5′-GACGCTTCTCCA

GACTACAAT-3′）[4]進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為50 μL，其中10×Ex Taq buffer 5 μL、dNTP（10 mmol/L）3.0 μL、正反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、Ex Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，用滅菌蒸餾水補足體積。PCR反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 0.5 min，52 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.0 min，33個循環；72 ℃ 7 min。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后送樣測序。

1.2.2 序列分析 采用DNAMAN軟件進行序列拼接，基于隱馬爾可夫模型的HMM方法（http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）獲取純ITS2區序列[5]，并采用Bankit軟件向Genbank提交植物樣品實驗所獲序列；利用ClustalX軟件進行序列比對；采用MEGA5.1軟件分析基于ITS2序列的供試物種間遺傳距離，并構建基于Kimura 2-parameter （K2P）模型和Neighbor-Joining（NJ）鄰接法構建系統發育樹（1 000次重復bootstrap檢驗各分支的支持率）。

2 結果與分析

2.1 DNA提取和PCR擴增

由于本研究采集的巴戟天植物樣本存在生長年限、生長階段以及化學成分含量等差異，利用通用植物DNA提取試劑盒提取的巴戟天DNA效果不盡相同，但巴戟天DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳上均顯現出目的條帶（圖1），可用于后續實驗。

以上述巴戟天DNA樣品為模板，經PCR擴增獲得約500 bp的ITS2片段（圖2），與預期相符合。將PCR產物純化后送樣測序，并將獲得的序列提交Genbank（登記號見表1中的KJ000533、KJ000534）。

2.2 序列差異分析

本研究所獲巴戟天及其混偽品ITS2序列共有22條，序列長度為224～244 bp，GC含量范圍為59.8%～70.1%。所有ITS2序列比對后的長度為253 bp，其中巴戟天及其8種混偽品存在155處變異，鑒別信息位點為151個；巴戟天的7條序列僅存在2處變異，分別為26 bp的C-T和46 bp的G-A變異（圖3），表明巴戟天與偽品間的差異程度遠遠高于巴戟天種內變異水平。

2.3 遺傳距離分析

基于K2P模型計算的巴戟天及其混偽品遺傳距離如表2所示，巴戟天種內K2P遺傳距離為0.005～0.010。在種間，最大的種間K2P遺傳距離來源于巴戟天與鐵箍散，達0.771，最小的種間遺傳距離則來自巴戟天與同屬的假巴戟天和羊角藤，為0.025。巴戟天與偽品間的遺傳距離遠大于巴戟天種內遺傳距離，說明在ITS2序列中有足夠的差異鑒別巴戟天以及混偽品。

2.4 聚類分析

基于ITS2條形碼構建的巴戟天與8種混偽品的聚類樹如圖4所示，22個樣品主要聚成4個分支。巴戟天的全部樣品首先單獨聚在一起，然后再與同屬的假巴戟、羊角藤和雞眼藤聚成一支，隨后再與同科虎刺屬的虎刺、短刺虎刺聚集，這與傳統分類結果相一致。其余3種偽品與巴戟天差異較大，另外聚成2個分支。各分支支持率均在90%以上，表現出明顯的單系性，而且區分效果良好，可見ITS2條形碼能夠很好鑒定巴戟天及其混偽品。

3 討論與結論

DNA條形碼（DNA barcoding）技術在2003年由分類學家Hebert等[6]提出，是利用一段較短的標準DNA序列來實現物種的快速、準確鑒別。迄今為止，已有多種核片段和質體基因及其組合被提議為植物DNA條形碼[7]。其中，ITS2條形碼在來源于753個屬4 800個種的6 000余個藥用植物樣品的鑒定成功率高達92.7%，被認為是藥用植物通用DNA條形碼[4]。目前，ITS2條形碼已經廣泛應用于砂仁[8]、青天葵[9]、兩面針[10]等多種嶺南道地藥材的真偽鑒別。本研究利用變異程度較大的ITS2條形碼也成功區別巴戟天及其8種常見混偽品，而且ITS2條形碼長度較短（250 bp左右），大大降低了DNA提取、PCR擴增和測序的難度，有利于發生降解的藥材樣品的序列獲取。

DNA條形碼技術以物種遺傳信息為鑒別依據，不受物種發育階段和藥材狀態的限制，擺脫了傳統鑒定方法對專業背景的要求，有利于非分類學專業人員對中藥材進行快速、準確的鑒定。陳士林[11]應用ITS2條形碼等序列完成了2010版《中國藥典》中200多味中藥材的真偽鑒別，而且國家藥典委員會在2012年公布了《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則》，說明DNA條形碼具有良好的推廣和應用價值。DNA條形碼或會接棒傳統鑒別方法，這將是中藥分子鑒定方法學上的創新，對傳統醫藥的國際化也有著推動作用。

本研究建立起巴戟天及其混偽品基于ITS2條形碼的鑒別體系，為巴戟天的真偽鑒別和用藥安全提供了保障，也可為DNA條形碼作為藥典收載巴戟天鑒別標準提供一定的參考。

參考文獻

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[11] 陳士林. 中藥DNA條形碼分子鑒定[M]. 北京： 人民衛生出版社， 2012.

責任編輯：黃 艷