海南省可可黑果病病原鑒定及其發生規律

桑利偉等

摘 要 采用形態特征鑒定及rDNA-ITS序列分析相結合的方法，對海南可可黑果病病原進行鑒定，并通過定點連續調查研究該病在海南的發生規律。結果表明，該病病原為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。降雨量對該病的發生有著顯著的影響，在海南發病高峰期一般在9～11月份。

關鍵詞 可可黑果病；病原鑒定；核糖體DNA-ITS；發病規律

中圖分類號 S432.44 文獻標識碼A

Pathogen Identification and Occurrence of Cacao

Black Pod in Hainan Province

SANG Liwei1，2， LIU Aiqin1，2 *， SUN Shiwei1，2， GAO Shengfeng1，2

GOU Yafeng1，2， TAN Lehe1，2

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China

2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and

Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract Cacao Black pod is an important disease threatening cocoa industry， The pathogen and occurrence of cacao black pod were studied through the morphological characteristics and the sequence of ribosomal DNA-ITS.Results showed that the pathogen from Hainan was Phytophthora citrophthora and the weather condition had obvious effects on the occurrence of the disease， especially for rainfall. The period of peak incidence in Hainan is September - November.

Key words Cacao Black pod； Pathogen identification； Ribosomal DNA-ITS； Occurrence

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.023

可可（Theobroma cacao L.）是世界三大飲料作物之一，產量僅次于咖啡和茶葉。可可果實營養豐富，味醇香，具有興奮與滋補作用，可可豆加工成可可脂和可可粉，可可脂主要用于制作巧克力，可可粉用來配制高級飲料。現在世界主要產地為委內瑞拉、巴西、加納等熱帶地區。中國1922年引入臺灣，1954年引入海南島試種[1]。1960年中國熱帶農業科學院香料飲料研究所（原興隆試驗站，以下簡稱“香飲所”）引種試種，對可可的生物學特性及適應性進行了長期系統的觀察研究，證實可可適合在海南省東南部發展[2]。目前，海南省可可種植面積為70多hm2，主要分布在萬寧和陵水。目前我國所需可可豆主要靠進口，種植可可市場前景廣闊。

可可黑果病（又稱可可疫病）是為害可可最嚴重的一種真菌病害，主要危害可可果實，引起黑色腐爛，產量損失可達50%[3]。2010年10月，在香飲所可可種植園首次發現該病，主要為害嫩果，為害率達15%左右。此后有擴大蔓延之勢，對可可產業的推廣發展造成很大威脅。準確地鑒定引起該病的病原菌并摸清其發生規律是制定防控策略的基礎。國外報道可可黑果病的病原主要有Phytophthora palmivora、P. citrophthora、P. megakarya、P. capsici等[4]，其中，Phytophthora palmivora是世界性分布，P. citrophthora和P. capsici主要為害巴西、印度、墨西哥等的可可果，P. megakarya則在喀麥隆、加蓬、加納、尼日利亞等的受害可可果中被發現。關于海南省可可黑果病的病原及其發生規律還未見報道。本研究采用形態學特征鑒定和核糖體DNA-ITS 序列分析相結合，對海南可可黑果病病原進行鑒定；通過定點定期觀察，摸清該病發生流行與氣候條件之間的關系，以期為進一步開展可可黑果病防治技術研究提供科學依據，為海南可可產業的快速發展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從香飲所可可種植基地發生可可黑果病的果實中分離獲得致病菌株“kk6a”，保存于香飲所病蟲害防控研究室。

1.1.2 試驗試劑 PDA培養基：稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛（煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用四層紗布過濾，再加葡萄糖16 g和瓊脂15 g，繼續加熱攪拌混勻，稍冷卻后加去離子水至1 000 mL，（121 ℃）滅菌20 min左右后取出備用。

快速DNA提取檢測試劑盒（KG203）：由天根生化科技（北京）有限公司生產。

1.1.3 試驗儀器 專業顯微數碼攝像系統、PCR儀、凝膠成像系統、高速冷凍離心機等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及其致病性測定 從香飲所可可種植基地采集發病的可可果樣品帶回實驗室進行分離，同時記錄田間為害癥狀，分離及致病性測定方法參見文獻[5]。

1.2.2 病原菌鑒定

（1）形態特征鑒定。方法參見文獻[6]。將病原菌接種到PDA培養基平板上培養5 d后，觀測菌落、菌絲的形態特征；從菌落邊緣切取1.5 mm×1.5 mm的菌絲塊，移至滅菌水中，在25 ℃光照條件下培養5 d，每隔12 h換1次滅菌水，在顯微鏡下觀測孢子囊的形態大小等特征；將待測菌株分別與Phytophthora palmivora A1、A2標準菌株在PDA平板上進行配對培養，半個月后觀察是否產生卵孢子。

（2）rDNA-ITS序列分析。基因組DNA提取、PCR反應參數以及擴增產物的克隆參照王源超[7]的方法，采用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAAC

CTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT

GC-3′，PCR產物送交上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。利用Mega 5.0系統發育分析軟件對病原菌rDNA-ITS序列構建系統發育樹。

1.2.3 發生規律觀察 2011～2013年，在香飲所可可種植基地隨機選取5個小區[8]，每小區選10株，小區面積50 m2，共50株。每隔10 d調查1次，每月調查3次，計算每個月的平均發病率。試驗小區生長季節不進行藥劑防治，水肥管理及農事操作正常進行。每月平均降雨量、平均溫度及相對濕度等氣象資料由萬寧市氣象局和香飲所生態研究室提供。運用SPSS軟件，分析病害發生率同降雨量、溫度及相對濕度等氣象因子之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 為害癥狀

病菌主要侵害莢果。莢果染病（圖1），開始在果面出現細小的半透明斑點，很快變褐色，后變黑色，斑點迅速擴大，直到整個莢果表面被黑色斑塊覆蓋。潮濕時病果表面長出一層白色霉狀物，剖開病果內部組織變褐色。后期病果干縮、變黑、不脫落。

2.2 病原菌分離及其致病性測定

從采集的樣品中分離獲得菌株“kk6a”。按照柯赫氏法則，結果發現將菌株“kk6a”回接后可可果的表現癥狀與田間自然為害癥狀一致（圖2），且從發病可可果上可以重新分離到該菌株，因此確定菌株“kk6a”是可可黑果病的致病菌。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態特征 菌株kk6a在PDA培養基上菌落生長茂盛，絨毛或綿絮狀，呈白色（圖3）。菌絲粗2～6 μm，平均4 μm；具少量球形菌絲膨大體，頂生，直徑24～35 μm（圖4～5）。孢子囊形態變異較大，卵形、橢圓形、倒梨形或不規則形，基部圓形，大小為29～91 μm×25～49 μm，平均60 μm×30.2 μm，長寬比為1.1～2.1，平均1.7；具明顯乳突，大多1個，少數2個，乳突高2～6 μm；孢子囊不脫落，柄長8～20 μm。孢囊梗簡單合軸分枝、不規則分枝或不分枝，粗1.5～4.0 μm（圖6）。在PDA培養基上與標準菌配對培養，未見有性器官產生。

以上形態特征表明，菌株kk6a可能是柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。

2.3.2 rDNA-ITS序列分析 分析結果表明，菌株“kk6a”的rDNA-ITS基因序列長度為828 bp（GenBank登錄號為KF269243）。將菌株kk6a的rDNA-ITS序列在GenBank中進行同源性比對，發現與其同源性最高的150個ITS序列菌株全部為疫霉菌，同源性達到94%～100%，其中與菌株KF269243.1、GU111603.1、GU111602.1的同源性分別為100%、99%和99%，這3個菌株均為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。結合形態學特征和核糖體DNA-ITS序列的分析，進一步利用Mega 5.0系統發育分析軟件建立菌株kk6a的系統發育樹，結果是菌株kk6a的序列與GenBank中Phytophthora citrophthora（登錄號：KF269243.1）的遺傳距離最近，位于系統發育樹的同一分支（圖7）。進一步證明了本研究從香飲所可可種植基地受害果中分離的致病菌kk6a為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。

2.4 病害發生規律

由圖8～10可見海南可可黑果病的發生規律。SPSS相關性分析結果表明，2011年該病發生率與降雨量、相對濕度及氣溫的相關系數（r）分別為0.76、0.74和0.32（p=0.01），2012年相關系數（r）分別為0.77、0.43、0.21，2013年相關系數（r）分別為0.95、0.61和0.19。可見，發病率與降雨量之間具有很強的相關性（r=0.76～0.95），降雨量越多，發病率越高；發病率與相對濕度之間的相關性中等（r=0.43～0.74）；發病率與氣溫之間呈弱相關（r=0.19～0.32）。

降雨量是影響可可黑果病發生和流行的最主要因素。在海南，此病菌在旱季進入休眠狀態，病菌在表層土壤、殘留在樹上的病果或其他寄主植物中存活，2～3月份連續一段陰雨天后，從這些處所產生孢子囊，孢子囊主要借雨水濺散傳播，為流行提供初侵染菌源，可可植株開始出現零星病果，發病率一般在5%左右；直到5月份出現雨水較多之前發病率一般不超過15%；6～8月份氣溫高雨水較少，出現短暫干旱，病害停止發展，發病率降低；到9～11月份臺風雨季，連續強降雨后發病率急劇上升，嚴重時發病率達40%以上；12月至翌年1月出現低溫少雨干旱天氣病害流行結束。2012年10月底至11月中旬，可可樹同時出現開花、結小果、成熟果的物候期，且興隆地區連續出現降雨天氣，氣溫均在20～30 ℃之間，所以這段時間可可疫病相對嚴重，發病率40%左右。總之，在持續高濕的地區黑果病特別嚴重，小果期連續降雨且出現20～27 ℃的氣溫是該病發生的主要條件。

3 討論與結論

可可黑果病可由多種病原菌引起，Blaha G[4]利用同工酶技術和RFLP方法鑒定發現Phytophthora palmivora（sensu stricto）、P. megakarya、P. capsici和P. citrophthora等均可引起可可黑果病。徐同等[9]從喀麥隆主要可可產區自然發病的黑果病病果中分離到12個疫霉菌株，并對這些疫霉菌株的形態學、生理特征及致病性進行了鑒定，結果這12個疫霉菌株均為P. megakarya。本研究采用形態特征鑒定及rDNA-ITS序列分析相結合的方法，將海南可可黑果病病原鑒定為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。由于本研究調查范圍和取樣數量有限，是否也有其他幾種國外報道的疫霉菌引起該病還有待進一步研究。

Deberdt P等[10]研究指出由P. megakarya引起的可可黑果病的發病率與降雨量之間呈顯著正相關，但未明確氣溫和濕度與該病發病率之間的相關性大小。本文研究結果表明，在海南，可可黑果病發病率與降雨量之間具有很強的相關性（r=0.76～0.95），降雨量越多，發病率越高；發病率與相對濕度之間的相關性為中等（r=0.43～0.74）；發病率與氣溫之間呈弱相關（r=0.19～0.32）。在海南，可可幾乎周年都可開花，但以每年5～11月開花最多（占全年的94%左右），從開花到結成幼果將近2個月時間，因此7～11月正是幼果期集中的時期，而8～11月恰逢高溫多雨和臺風雨季節，因此可可黑果病的發病高峰期與幼果期相對一致，這也說明該病菌主要侵染幼果。在生產上建議在每年8月中下旬雨季來臨前，全園進行可可黑果病預防，否則嚴重時可導致40%以上的可可幼果腐爛脫落，嚴重影響產量。

本次將菌株kk6a在PDA平板上進行單株培養及與Phytophthora palmivora A1、A2標準菌株進行配對培養，都未發現有性器官產生，可能是本研究所獲得的菌株喪失了育性或育性較弱。ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的區域，該區域進化速度較編碼區快，已有的研究結果表明，ITS在真菌的種間存在著豐富的變異，而在種內不同菌株間卻高度保守，可以為真菌的系統發育和分類鑒定提供豐富的遺傳信息。本研究采用分子生物學方法對海南可可黑果病致病菌kk6a的核糖體DNA-ITS序列進行分析，其核糖體DNA-ITS序列與柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）的同源性為100%，從分子生物學水平上進一步鑒定菌株kk6a為柑橘褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora）。

參考文獻

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責任編輯：沈德發