咖啡葉銹病菌轉錄組SSR信息分析

吳偉懷等

摘 要 咖啡葉銹病是咖啡一種毀滅性病害。利用GRAMENE網站提供的SSR鑒定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool），對咖啡葉銹病菌8 310條無冗余的EST分別進行SSR鑒定。結果共搜查到1 292個1～6堿基SSR，出現頻率最高的為三堿基重復基元類型，其次為二堿基重復基元類型與六堿基重復基元類型。分別為459、321與214個，其出現頻率分別為35.5%、24.8%與16.6%。AT/AT為二核苷酸中優勢重復類型，占其總數的49.8%；而ATC/ATG與AAG/CTT則為三核苷酸中優勢重復類型，二者分別占三核苷酸SSR總數的23.5%與23.3%。進一步對SSR多態性進行了預測，從而篩選出長度在22 bp以上具有潛在多態性的SSR 223個。此結果對于咖啡葉銹病菌群體遺傳變異、多樣性和進化等研究提供了分子標記。

關鍵詞 咖啡葉銹病菌；轉錄組；SSR

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

Transcriptome Sequences SSR Information Analysis

of Coffee Leaf Rust

WU Weihuai1， ZOU Haijuan2， HE Chunping1 *， LIANG Yanqiong1

XI Jingen1， ZHENG Xiaolan1， ZHENG Jinlong1， LI Rui1， YI Kexian1 *

1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS， Haikou / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control

of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical

Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

2 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan， 570228， China

Abstract Leaf rust， caused by Hemileia vastatrix， is a devastating disease of coffee plants（Coffea arabica L.）. In this study， simple sequence repeat identification tool（SSRIT）was used to screen Simple Sequence Repeat（SSRs）in coffee leaf rust transcriptome. A total of 1 292 SSRs were found in coffee leaf rust transcripts. Of the 1 292 SSRs， the most abundant SSR is the tri- nucleotide type， with the SSR numbers being 459， followed by the di- and hexa- nucleotide ones， with 321 and 214 SSR numbers， accounting for 35.5%， 24.8%，and 16.6%， respectively. Among the di-nucleotide repeats， AT/AT was the most motifs and accounted for 49.8%. However， ATC/ATG and AAG/CTT were both the most frequent motif among the tri-nucleotide repeats， accounting for 23.5% and 23.3%， respectively. Furthermore， the polymorphism of SSRs was assessed by filter out in the length of more than 22 bp SSR， and 223 potentially polymorphism SSRs were identified. Therefore， these results are useful to analyze genetic viaration， diversity， and evolution of coffee leaf rust pathogen.

Key words Coffee leaf rust； Transcriptome； Simple sequence repeat（SSR）

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.024

由Hemileia vastatrix引起的咖啡葉銹病是咖啡一種主要病害[1]。在適宜的氣候條件下該病嚴重發生時，可以導致葉片損失最多可達50%，漿果損失可高達70%[2]。采用抗性品種是控制該病害比較經濟適用與環保的方法[3-4]。然而，培育新的抗性品種需要花費大量的時間，即使是培育出來的抗性品種在推廣幾年后仍然面臨著由于病原菌的變異而克服其抗性的風險[5]。由此可見，如何利用現代分子標記技術快速掌握與監測病原菌小種與寄主互作過程中群體動態變化及其趨勢，對于防止咖啡葉銹病有著十分重要的意義。

在許多分子標記中，SSR分子標記由于其具有信息量豐富、多等位性以及共顯性等特點被公認為是檢測與監測病原菌變異中一種理想的分子標記。目前已成功從稻瘟病菌[6]、粗糙脈孢菌[7]、構巢曲霉菌[8]、禾谷鐮刀菌[9]，以及劍麻莖腐病菌[10]等多種植物病原菌中開發出了SSR標記并廣泛應用。最近2個來自咖啡葉銹病菌冬孢子與附著胞的轉錄組數據已經公布[11]，這為開發咖啡葉銹病菌EST-SSR標記提供了可能。為此，筆者利用咖啡葉銹病菌冬孢子與附著胞的共9 234條轉錄組數據，從中查找并分析咖啡葉銹病菌SSR序列信息，以期為進一步利用這些SSR信息奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從網站http：//www.frontiersin.org/journal/10.3389/

fpls.2014.00088/abstract下載9 234條咖啡葉銹病菌轉錄組數據。

1.2 方法

1.2.1 數據預處理及其SSR位點篩選 利用blast 軟件進行比對，以相似度 大于80%時即為同一個EST的標準進行拼接，從而獲得Unigene；利用SSRIT在線分析軟件（http：//www.gramene.org/db/searches/ssrtool）對Unigene序列進行SSR搜索。SSR篩選的標準為：單核苷酸，二、三、四、五和六核苷酸的最少重復次數分別為20、6、5、4、3、3 次以上。

1.2.2 SSR引物設計 對鑒定出的各EST-SSR進行比較，選取含有堿基數較大的SSR的核苷酸序列，在其基元上下游合適的位置，通過軟件primer5.0設計引物。設計引物基于下列原則： 引物一般要求GC含量40%～65%，Tm值55～65 ℃，引物序列長18～25 bp，且無錯配、不形成二聚體和發夾結構等。

2 結果與分析

2.1 葉銹病菌EST-SSR 類型及其出現頻率

9 234條咖啡葉銹病菌轉錄組數據序列，經過去冗余處理后得到8 310條無冗余的Unigene，總長度為5.3×106 bp，經搜索共發掘出1 292個SSR，分布在997條無冗余的EST上，發生頻率為12%（含有SSR的EST與無冗余EST數之比），SSR平均分布距離為4.1 kb。其中有199條EST序列中包含有1個以上SSR（表1）。在1 292個SSR中，單核苷酸，以及二、三、四、五、六核苷酸SSR分別為17、321、459、101、180和214個，其出現頻率分別為1.3%、24.8%、35.5%、7.8%、13.9%與16.6%（圖1）。由此表明，出現頻率最高的為三核苷酸基元類型、其次為二核苷酸基元類型、接著為六核苷酸基元類型。而就SSR重復次數數量而言，出現頻率較高的則是重復數為4、6以及7，三者出現次數均在200次以上（數據未列出）。

2.2 二核苷酸堿基元組成及其頻率

由于二、三核苷酸基元類型分布最為廣泛，為此進一步對二者核苷酸基元及其頻率作進一步地深入分析。在321個二核苷酸SSR中，共存在AC/GT、AG/CT、AT/AT以及CG/CG等4種核苷酸基元類型，其數量分別為49、111、160及1個，分別占二核苷酸SSR總數的15.3%、34.6%、49.8%及0.3%。由此可見，AT/AT基元為二核苷酸SSR中最為豐富類型（圖2）。

2.3 三核苷酸堿基元組成及其頻率

在三核苷酸SSR中共存在10種不同基元類型，根據其出現頻率又可分為4種類型：第一類為出現次數最多的2個基元ATC/ATG與AAG/CTT，分別出現108和107次，占三核苷酸SSR總數的24%與23%；第二類為出現次數介于40～60次，包括AAC/GTT與AAT/ATT等2種基元類型，二者出現次數分別為56及53，其出現頻率依次為12.2%及11.5%。第三類為出現次數介于20～39之間，包括ACT/AGT、AGC/CTG、ACC/GGT與AGG/CCT等4種基元類型；第四類則為出現次數低于10，包括ACG/CGT與CCG/CGG 2種基元類型，二者均只出現7次（圖3）。

2.4 所發掘的葉銹菌EST-SSR多態性預測及引物設計

由于多態性是判斷分子標記可用性的一個重要依據。而SSR標記多態性又與其基元重復數密切相關[12]，而且重復數越高，其變異概率越大[13-14]。為此，進一步過濾掉多態潛能較低的22 bp以下SSR。即單核苷酸，二、三、四、五和六核苷酸的最少重復次數分別為22、11、8 、6、5、4次及以上。結果表明，搜索出大于22 bp SSR共計223個（表2），占總SSR的17.3%。在223個EST-SSR其上下游合適位置設計引物。推測這些SSR在咖啡銹菌上具有比較豐富的多態性。表3僅列出了其中20對SSR引物。

3 討論與結論

咖啡葉銹病是威脅小粒咖啡的重要病害[1]。該病原菌目前具有至少45個生理小種，因此如何快速、準確地了解該病原菌的生理小種的變化動態對于預警與防控該病害有著十分重要的作用。傳統監測該病害的生理小種動態及變化趨勢一貫采用鑒別寄主，依據鑒別寄主的反應型最終確定其生理小種。該方法不僅費時而且費力。因此，如何利用現代分子標記技術快速準確監測病原菌的變化情況是一條比較快捷的途徑。

SSR標記已經成為一種有效的、應用最廣泛的分子工具，已廣泛地用于病原菌的遺傳多樣性、連鎖圖譜構建、比較基因組學及關聯分析等領域[6，15]。SSR標記開發途徑歸納起來有3條，其一為基于基因組序列進行SSR位點篩選；其次是利用同源或相關物種SSR信息而開發標記，通過驗證其轉移性，從而到達開發目的物種或病原菌SSR[16]；第三則是基于現有轉錄組數據庫信息進行SSR標記開發。在這三種方法中，第一種方法由于基于基因組序列，分析工作量比較大，而且如果沒有已測序的話，則開發成本較高；第二種方法則常常面臨轉移率的問題，限制了SSR開發的效率；比較而言，利用 EST 數據開發 EST-SSR 標記比較簡單有效，并且 EST 本身是基因的一部分，其變化可能直接導致與該基因相關功能的改變。

隨著生物技術的高速發展，以及高通量技術的應用和測序費用不斷降低，越來越多的病原菌基因組與轉錄組數據被釋放和公布。這為開發SSR標記提供了豐富的資源。本研究對咖啡葉銹病菌冬孢子與附著胞的轉錄組數據中的8 310條無冗余的Unigene 進行了 SSR 搜索，結果共篩選到1 292個1～6堿基SSR，分布在997條無冗余的EST上，發生頻率為12%。在搜索出來的SSR中，其中出現頻率最高的為三堿基重復基元類型、其次為二堿基重復基元類型與六堿基重復基元類型。而早前對劍麻莖腐病菌基因組SSR的分析結果表明，含9個堿基重復基元類型最多，其次為6個堿基重復基元類型，接著為3個堿基重復類型[10]。比較而言，在構巢曲霉菌基因組中，五核苷酸基元類型為優勢的類型，其次為六堿基以及三堿基類型，而最少的類型則是二核苷酸重復類型[8]。在粗糙脈孢菌基因組中，其主導類型是三堿基SSR，數量達到4 729個，其次為六堿基SSR（2 940個）和單堿基SSR（2 489個）；而數量最少的是二堿基SSR[7]。由此表明，不同病原菌菌體中SSR類型存在明顯差異。上述這些差異一方面可能是由于不同病原菌之間的真實SSR信息差異，但也有小部分可能由于搜尋SSR時所設定長度最低標準等參數設置的不同而導致的。

除此之外，不同病原菌主導重復基元的類型也存在著差異。在本研究中，二堿基重復基元類型SSR中，共存在AC/GT、AG/CT、AT/AT以及CG/CG等4種類型，其中AT/AT為主導類型，而在三堿基重復基元類型中共存在10種不同基序，其中ATC/ATG與AAG/CTT為主導類型。這與水稻稻瘟病菌中SSR 的分布有明顯差異，因為在其雙核苷酸SSR中，數量最多的是AG類；三堿基SSR中，ACG、AGC、AAG和GGC是其中主要的組成部分，每一類SSR的數量都在500個以上[17]。

本研究進一步過濾了多態潛能較低的22 bp以下SSR，最終共獲得了223個SSR。推測這些引物在咖啡葉銹病菌中具有豐富的多態性。當然，這些標記是否如推測的那樣具有豐富的多態性，還需要進一步地驗證。

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