鋸葉棕苗期葉斑病菌（Calonectria pteridis）生物學特性及其對11種殺菌劑的毒力反應

鄭麗等

摘 要 對鋸葉棕苗期葉斑病病原菌（Calonectria pteridis）的生物學特性進行初步研究，結果表明：該病原菌菌絲生長適宜溫度范圍為28～30 ℃，適宜生長pH范圍為5.0～6.0；分生孢子萌發最適溫度為28 ℃，最適pH為5.5。菌絲對碳源的利用效果由高到低依次為D-木糖、D-果糖、蔗糖、D-葡萄糖、D-山梨醇、D-乳糖、D-麥芽糖和肌醇；對氮源的利用效率以草酸銨最高，明顯優于其他氮源，而分生孢子的萌發受不同碳、氮源的影響較小。在室內采用菌絲生長速率法，測定11種殺菌劑對菌絲生長的抑制作用，結果表明：50%多菌靈和70%甲基托布津的EC50值最小，分別為0.486 4和2.958 9 mg/L；而80%代森鋅和15%三唑酮的EC50值最大，分別為130.160 3和159.737 9 mg/L，抑菌效果最差。

關鍵詞 鋸葉棕；葉斑病；生物學特性；殺菌劑篩選

中圖分類號 S436.421.1 文獻標識碼 A

Biological Characteristics and Screening of Fungicides of

the Pathogen Fungi of Saw Palmetto Leaf Spot in

the Seeding Stage

ZHENG Li1， YANG Wei3， QIN Xindao1， TIAN Wanying4， LI Jing1， XIE Changping2 *

1 Guangzhou Experimental Station / Tropical Energy and Ecology Research Centre， Chinese Academy of Tropical

Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510140， China

2 College of Environment and Plant Protection， HainanUniversity， Haikou， Hainan 570228， China

3 School of Life Science， Huaiyin Normal University， Huaian， Jiangsu 223300， China

4 Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Biological characters of Calonectria pteridis which causes leaf spot on Saw Palmetto were determined in the study. The results indicated that the optimal temperature for mycelium growth was 28-30 ℃， and the optimal pH was 5.0-6.0. The optimal temperature for conidium germination was 28 ℃， and the optimal pH was 5.5. The order of carbon sources utilization against C. pteridis was： D-xylose， D-fructose， D-glucose， D-sorbitol， D-lactose， D-maltose and inositol， while the ammonium oxalate was the best nitrogen source for mycelium growth. But there is no significant impact of carbon source and nitrogen source on conidium germination. Inhibition activity of 11 common fungicides against C. pteridis was also detected. According to the results， the best inhibition activities were gained by 50% carbendazim and 70% thiophanate-methyl while their EC50 values was 0.4864 and 2.958 9 mg/L， respectively. In contrast 80% zineb WP and 15% triadimefon EC was 130.160 3 and 159.737 9 mg/L， which showed the worst inhibition activities to the pathogen.

Key words Saw palmetto； Leaf spot disease of Calonectria pteridis； Biological characteristics； Screening of Fungicides

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.030

鋸葉棕[Serenoa repens（Bartr.）J. K. Small]，屬棕櫚科（Palmae Juss.）鋸葉棕屬（Serenoa Hook.F.），是鋸葉棕屬唯一代表植物，是一種重要的藥用棕櫚植物，同時也可作為觀賞植物，供庭院種植[1]。據《美國藥典》和《英國藥典》記載，其果實內的提取物具有抗菌消炎、祛痰平喘、鎮靜、解痙、調節內分泌、促進泌乳、利尿、促進食欲以及抗腫瘤之效，可治療50多種疾病，是美國最暢銷的十大植物藥物之一[2]，也是最有效的治療良性前列腺肥大癥狀（Benign Prostatic Hyperplasia，BPH）的植物藥物之一[3]，在全球的銷售總額僅次于人參和銀杏[1，4]。

中國海南省的氣候條件適合鋸葉棕生長。在2003年12月和2004年4月，廣西亞熱帶作物研究所與美國加州灣食品科技公司合作， 先后引進鋸葉棕種子2.4萬粒，進行引種、試種適應性觀測。近年來，在中國海南省儋州勁芳種植基地和私人農場，均有引種、栽培[5]。

國內外對鋸葉棕病害報道較少，常見病害有心腐病，根腐病和炭疽病[6]。筆者2010年在海南儋州市某鋸葉棕苗圃病害的調查中，發現苗期葉片上出現一種由蕨氏麗赤殼菌（Calonectria pteridis）引起的葉斑病[7]，危害嚴重時，整株葉片脫落。現在病原菌鑒定的基礎上，對其進行了生物學特性研究和室內藥劑篩選，為葉斑病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 實驗室保存的蕨氏麗赤殼菌（Calonectria pteridis Wolf）。

1.1.2 試劑和藥品 各種生理生化試劑均為國產分析純，實驗供試藥劑見表1。

1.1.3 儀器和設備 DHZ-DA搖床（太倉市儀器設備廠）；GXZ培養箱（寧波江南儀器制造廠）；SMZ-140解剖鏡（Motic）；PHS-3C精密pH計（上海雷磁儀器廠）；SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌生物學特性的測定

（1）光照對菌絲生長的影響。用滅菌打孔器在PDA培養基上培養4～5 d的菌落邊緣打孔，將菌塊接種到PDA培養基平板中央，設置完全黑暗，完全光照，光暗交替（各12 h）3個處理，放置在28 ℃全光照（3 000 Lux）恒溫培養箱中培養4 d，第5天測量菌落直徑，每個處理重復3次，同時觀察產孢情況。

（2）溫度對菌絲生長和分生孢子萌發的影響。對菌絲生長影響：將菌絲塊接種到PDA平板中央，分別置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的全光照（3 000 Lux）恒溫培養箱中培養，觀察菌絲生長情況，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次。

對分生孢子萌發影響：從純化菌落表面挑取分生孢子，用無菌水配成孢子懸浮液，然后在低倍鏡（10×10）下檢查孢子數，用無菌水調節孢子數，至20～25個孢子/視野。

在經高壓滅菌的載玻片上均勻涂上用無菌水稀釋過的PDA培養基，待培養基凝固后，將2滴調節好孢子數量的分生孢子懸浮液涂在培養基上，并使其均勻分布，然后將其放入墊有濕濾紙的培養皿內，倒置，分別置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的全光照恒溫培養箱中培養3.5 h，取出用0.1 mg/mL升汞固定以后，用顯微鏡在10倍鏡下檢查分生孢子的萌發情況，隨機選100個孢子檢測其萌發率，每個處理3重復。

（3）pH對菌絲生長和分生孢子萌發的影響。制作好PDA培養基，用無菌的0.1 mol/L的HCl和NaOH將pH調節到4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，高溫滅菌（121 ℃，20 min），冷卻后，再用無菌的0.1 mol/L的HCl和NaOH重新調節pH值后倒入已滅菌的培養皿中制成平板。

用（2）的方法，接種病原菌到不同pH的培養基平板中央，測定不同pH對菌絲生長和分生孢子萌發的影響。置于28 ℃全光照（3 000 lx）恒溫培養箱中培養，每個處理重復3次。

（4）碳源、氮源對菌絲生長和分生孢子萌發的影響。選用Richard培養基作為基礎培養基[8]，用等碳當量的碳源，分別為D-葡萄糖、D-木糖、D-山梨醇、D-乳糖、D-果糖、D-麥芽糖和肌醇依次置換Richard培養基中的蔗糖，配制不同碳源的培養基，不加任何碳源的Richard培養基作為對照。用等氮當量的氮源，分別為硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨和草酸銨依次置換Richard培養基中的硝酸鉀，配制成不同氮源的培養基，不加氮源的Richard培養基作為對照。將直徑為4.5 mm的菌絲塊接種在不同碳、氮源的Richard培養基平板的中央，重復3次，在28 ℃的全光照（3 000 lx）恒溫培養箱中培養5 d，第6 天觀察菌絲的生長和產孢的情況。

用（2）的方法，測定不同碳、氮源對菌絲生長和分生孢子萌發的影響。

1.2.2 室內藥劑篩選 采用菌絲生長速率法測定抑菌效果[8]。將每種供試藥劑加入滅菌后冷卻至40～45 ℃的培養基中分別制成平板，根據預設結果，將每種藥劑設置5個濃度處理，接種單個菌餅（Ф0=0.45 mm），設滅菌水對照，每個處理及對照重復3次。置于28 ℃全光照恒溫培養箱中培養5 d后檢查各處理中菌株的生長情況。十字交叉測量菌落直徑，計算生長抑制率。

抑制率=×100/%

Ф代表抑菌圈直徑。

計算濃度對數（X）與抑制菌落生長百分率的幾率值（Y），利用最小二乘法分別求得各藥劑對該菌的毒力回歸方程（Y=a+bX）、EC50和r。

1.2.3 數據分析 在Microsoft Excel中對平板抑菌圈、孢子萌發等數據，進行基本處理后，用SPSS（Version 16.0）通用線性模型中的Duncan's Test（p=0.05），One-Way ANOVA Analysis進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 生物學特性分析

2.1.1 光照對菌絲生長的影響 在不同的光照條件下，病原菌菌絲生長差異不大。在24 h完全光照和12 h光暗交替條件下，菌絲的色素顏色較24 h完全黑暗處理的淺；3個不同處理均產生菌核，但24 h完全黑暗處理產生的菌核量少于其它2個處理，各處理間無顯著差異（表2）。

2.1.2 溫度對菌絲生長和分生孢子萌發的影響

菌絲在15～35 ℃范圍內均能生長；在15～30 ℃范圍內，菌落直徑隨溫度升高而逐漸增大，30 ℃時菌落直徑最大；在15 ℃時菌絲生長緩慢；低于10 ℃或者高于40 ℃，菌絲均不能生長（圖1）。不同溫度條件下，分生孢子的萌發率不同；10 ℃以下孢子不萌發；在15～35 ℃的范圍內，孢子均能萌發，并且在15～28 ℃的溫度范圍，分生孢子萌發率隨溫度的上升而升高，在30～40 ℃的溫度范圍，分生孢子的萌發率隨溫度的上升而降低；40 ℃時孢子不萌發（圖1）。可見，病原菌分生孢子萌發適宜的溫度范圍是25～30 ℃，最適宜的溫度是28 ℃。

2.1.3 pH對菌絲生長的影響 pH4.0～11.0時病原菌的菌絲均能生長，但生長情況各不相同；pH4.0～5.5時菌落直徑呈上升趨勢，pH 6.0～11.0時呈下降趨勢（圖2）。適宜菌絲生長的pH范圍4.0～6.0。

pH4.0～11.0時病原菌分生孢子的萌發率不同；在pH4.0～6.0之間，分生孢子的萌發率隨pH的上升而升高；而在pH7.0～11.0之間，分生孢子萌發率隨pH的上升而降低（圖2）。病原菌孢子萌發最適宜的pH為5.5。

2.1.4 碳源、氮源對菌絲生長和分生孢子萌發的影響

同的碳源對菌絲生長的影響有所不同；在D-果糖、D-木糖中，菌落的直徑明顯大于其他碳源，D-果糖和D-木糖菌落大小與對照差異不大，但是從菌落性狀來看，D-果糖中的菌絲致密，氣生菌絲發達；D-木糖的菌絲稀疏，氣生菌絲發達；而對照的菌絲薄而稀疏，氣生菌絲極不發達（表3）。在不同的碳源下，分生孢子的萌發率不同；以蔗糖為碳源，孢子的萌發率明顯高于其他碳源，但與對照相比無明顯差異；其他的碳源中孢子的萌發率都明顯低于對照，以葡萄糖為碳源的分生孢子萌發率最低（表3）。

不同氮源對菌絲生長的影響有所不同，6種氮源中以草酸銨作為氮源時菌落直徑最大，明顯優于其他氮源和對照，并且草酸銨中的菌落菌絲致密，可見草酸銨作為氮源比較有利于菌絲的生長（表4）。不同的氮源對分生孢子的萌發率影響不同，其中氯化銨為氮源的分生孢子萌發率顯著低于其他種類氮源，而以硝酸鈉、硝酸鉀和硝酸銨為氮源，其孢子萌發率差異不顯著，但孢子萌發率高于其他氮源和對照（表4）。

2.2 藥劑毒力篩選結果分析

2.2.1 供試藥劑EC50值比較分析

根據EC50值，11種藥劑可分為4個類：EC50小于3.0 mg/L的多菌靈和甲基托布津均為苯并咪唑類殺菌劑 ，其抑菌效果最好；EC50介于5.00～31 mg/L之間的敵力脫、百菌清、腈菌唑和世迪分別屬于三唑類、取代苯類，抑菌效果依次降低；EC50在31～39 mg/L之間的拉爾米、醚菌酯和代森錳鋅分別屬于二硫代氨基甲酸衍生物、甲氧基丙烯酸酯類，EC50值較大，抑菌效果一般；EC50介于130～160 mg/L的代森鋅和三唑酮分別屬于二硫代氨基甲酸衍生物和三唑類，抑菌效果最差（表5）。

2.2.2 病菌對殺菌劑敏感性比較 對試驗結果進行相關回歸分析，得到每種殺菌劑的回歸方程和斜率，回歸方程斜率與病原菌對殺菌劑的敏感性成正比（表5）。按回歸方程斜率，供試藥劑可分為4類：多菌靈和甲基托布津斜率分別為2.967 8和2.875 0，是供試藥劑中斜率最大的，說明病原菌對苯并咪唑類藥劑敏感性很高；醚菌酯和代森錳鋅斜率分別為2.562 0和2.071 6，斜率較大，說明病原菌對它們的敏感性也較高；拉爾米和三唑酮的回歸方程斜率在1.569 5～1.355 3，斜率較小，病原菌對它們的敏感性較低；百菌清、代森鋅、腈菌唑、敵力脫和世迪，斜率在0.618 2～0.984 4，斜率很小，說明病原菌對它們的敏感性很低（表5）。

2.2.3 供試藥劑抑菌效果綜合分析

（1）苯并咪唑類。毒力回歸曲線的斜率與病原菌對殺菌劑的敏感性呈正比，因此可以配合EC50值來比較分析藥劑的抑菌效果，殺菌劑EC50值越小，毒力回歸方程斜率越大，說明隨著藥劑濃度的增加，對病原菌生長抑制作用提高越快。在11種藥劑中，多菌靈和甲基托布津2種苯并咪唑類藥劑的斜率值很接近，但其EC50值分別為0.834 8和2.958 9 mg/L，經差異顯著性分析，在0.05水平差異達到顯著。因此，可認為前者抑菌效果優于后者。

（2）三唑類。在4種三唑類藥劑中，敵力脫、腈菌唑、世迪、三唑酮，EC50值分別為5.691 8，15.725 6，

30.671 1，159.737 9 mg/L，而其毒力回歸方程斜率依次為0.776 8，0.796 6，0.618 2，1.355 3，差異顯著性分析顯示，腈菌唑和世迪間差異不顯著，敵力脫和它們的差異達到顯著，而這3種殺菌劑與三唑酮之間差異卻達到極顯著。因此，綜合分析，敵力脫效果最好，腈菌唑和世迪居中，三唑酮抑菌活性則最低。

（3）二硫代氨基甲酸衍生物及取代苯類。二硫代氨基甲酸衍生物（拉爾米、代森錳鋅、代森鋅）和取代苯類（百菌清）的EC50值分別為31.485 4，38.843 9，

130.160 3，12.212 2 mg/L，其斜率依次為1.569 5，

2.071 6，0.896 6，0.984 4，顯著性分析結果顯示，這4種藥劑之間差異達到極顯著。綜合分析，拉而米和百菌清抑菌效果應最好，代森錳鋅斜率值較大，但其EC50值亦較大，說明病原菌對其的敏感性較高，有一定的使用價值，并且它們和具有內吸性的苯并咪唑類和三唑類藥劑之間的差異達到極顯著，可以考慮混配使用。

（4）其他。醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，其EC50值為36.439 8 mg/L，而斜率為2.562 0，抑菌效果也很好。

3 討論與結論

對蕨氏麗赤殼菌（Calonectria peridis Wolf）的生物學特性的研究結果表明，菌絲適宜生長的溫度范圍是25～30 ℃，分生孢子萌發的最適溫度為28 ℃；筆者在田間調查時發現：植株種植密度較高，地勢低洼，排水不良的土地上鋸葉棕葉斑病發病較重，說明該病菌喜高溫高濕。并且該病害在海南6～11月發病率較高，平均發病率高達80%～90%。菌絲生長和分生孢子萌發的適宜pH為5.5，說明病菌適宜在偏酸環境中生存。防治該病時，要加強栽培管理，注意植株的種植密度，改善通風透光條件，改良土壤，雨季要注意田間排水，不在低洼地種植。

在室內藥劑篩選中，綜合考慮各種供試藥劑對病原菌的EC50和斜率發現，11種藥劑以苯并咪唑類的多菌靈和甲基托布津效果最好，三唑酮和代森鋅抑菌效果最差。代森錳鋅和代森鋅屬于同一類藥劑，抑菌效果卻存在明顯差別，原因有待進一步探討。三唑類4種藥劑，以敵力脫最好，但其市場價格比較高，適合推廣使用的為世迪和腈菌唑，而三唑酮效果最差，可能由于它比較常使用，使得菌株產生了一定的抗藥性[9]。這些僅僅是殺菌劑在室內對菌絲體生長抑制情況，可能對菌絲抑制效果藥劑存在漏篩現象。在進行田間防效時，還需考慮殺菌劑施用時期，防治成本等諸多因素。殺菌劑的田間藥效實驗防治與毒力測定的結果可能并不完全一致，需要大田防治試驗進一步確認，以篩選出高效殺菌劑交替輪換使用。

據報道，對帚梗柱孢屬孢子萌發抑制較好的首選藥劑有百菌清、多菌靈、甲基托布津、代森錳鋅[10]，與本試驗中菌絲生長抑制推薦使用的首選藥劑吻合。本實驗僅僅對菌絲生長進行藥劑篩選，由于此病菌傳播方式和越冬方式多為分生孢子和厚垣孢子以及微菌核[11]。因此，化學藥劑對病原菌孢子萌發的抑制試驗有待進一步研究，可以提高防治效果。

帚梗柱孢菌主要分布于熱帶、亞熱帶地區，中國種植棕櫚科植物的主要地區比較適合該病菌的生存與為害。生物防治的方法使用也較多，如越橘葉斑病防治采用生防細菌（枯草芽孢桿菌應用最廣）[12-13]、植物源物質（銀杏外種皮乙醇提取物效果最好）[14]、哈茨木霉菌株（T5菌株）[15]等。建議防治該病時，協調運用農業生物防治方法輔以化學藥劑預防病害的發生。

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責任編輯：古小玲