柑橘潰瘍病生防細菌的分離鑒定

陳嬌梅等

摘 要 為了從柑橘上獲得能防治柑橘潰瘍病的生防細菌，從福州3個地區的柑橘園采集不同柑橘品種的葉片、春稍和花，用稀釋分離法分離得到84株細菌菌株，用平板抑菌圈法篩選獲得11株對柑橘潰瘍病菌具有拮抗作用的菌株；用離體葉片防效篩選獲得39株對柑橘潰瘍病具有50%以上防效的菌株，占菌株總數的46.4%。對3株防效顯著的拮抗菌株YH1、YS5和NY20進一步進行防效測定，結果表明：菌株培養液的防治效果最好，菌體次之，代謝產物最差；對這3株細菌的β-1，4-葡聚糖酶、蛋白酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶活性進行測定，結果表明酶活性的強弱與防病效果有一定的相關性。經過16S rDNA序列分析，革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和生理生化測定，確定這3個菌株均屬于芽孢桿菌屬，其中菌株YH1鑒定為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus。

關鍵詞 柑橘潰瘍病；拮抗菌；芽孢桿菌；生物防治

中圖分類號 S476 文獻標識碼 A

Abstract To obtain biocontrol bacteria from citrus which could control citrus canker， 84 bacterial strains were isolated from leaves， spring shoots and flowers of different citrus varieties collected from three citrus orchards in Fuzhou. Among them， eleven isolates which could inhibit the growth of Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac.） were screened out by the inhibiting zone method. But when all isolates were used to control the pathogen on citrus leaves in vitro， 39 bacterial isolates had 46.4% control efficacy. Further tests showed that 3 strains， YH1， YS5 and NY20 had 90.9%-100% control efficacies against Xac. after 14 days of inoculation. The NB cultures， cells and metabolites of the 3 strains were tested in vitro to control the citrus canker on leaves. The results showed that the disease could be controlled by all treatments. But the cultures of the bacteria had the best control effect and the metabolites were the worst. Analyzing activities of the β-1，4-endoglucanase， protease and β-1，3-1，4-endoglucanase of the 3 strains showed that the enzyme activities had some certain correlation with disease control effect. Based on the results of 16S rDNA sequences analysis， gram， flagella and spore stains， physiological and biochemical tests， the 3 strains were identified as members of Bacillus， and the strain YH1 as B. pumilus.

Key words Xanthomonas axonopodis pv. citri；Antagonist bacteria；Bacillus spp.；Biological control

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.025

柑橘潰瘍病（Xanthomonas axonopodis pv.）是影響全球柑橘產業發展的重大頑固細菌性病害，已經被世界上30 多個國家和地區定為植物檢疫性有害生物[1]。目前中國以廣東、福建、臺灣、廣西、四川等省區的柑橘受害最重，湖南和其他柑橘產區也都有不同程度受害[2]。該病害可危害蕓香科數十種植物，傳播途徑廣、傳染迅速、危害嚴重，對農業生產造成巨大損失[3-5]。生產上主要使用的化學農藥依然是常見的幾種，缺乏推陳出新[6]。長期使用化學農藥不但會使病菌產生抗性，而且會污染環境，造成農藥殘留，對人體產生負面影響。近年來，隨著人們對農產品品質和安全性要求的提高，使柑橘潰瘍病的生物防治得到了重視，并開展了一系列的研究工作。如周吉奎等[7]報道了從柑橘葉片和果實表面分離的K-2與K-8兩株拮抗細菌在溫室和大田防治試驗中對柑橘潰瘍病都有良好的防治效果；張洪波等[8]在柑橘表面分離到的葡萄糖桿菌屬Kx15菌株和乳酸桿菌屬Kx48菌株，在溫室對柑橘潰瘍病的防治效果分別達到45.6%和55.6%；陳力等[9]研究確定了從柑橘葉表面分離的枯草芽孢桿菌CQBS03抑菌活性成分是蛋白質，對柑橘潰瘍病的抑菌活性高并且穩定。易龍等[10]從臍橙根際土壤分離的枯草芽孢桿菌G32，在室內對柑橘潰瘍病的預防效果達60.7%。譚小艷等[11-13]研究報道，從柑橘園土壤中、柑橘葉片表面和柑橘葉片中分別分離的鮑氏不動桿菌Bt8、枯草芽孢桿菌Bv10和洋蔥伯克霍爾德氏菌Bc51，在溫室測試中，分別獲得了55.2%、42.9%和60.3%的病斑抑制效果；以上這些研究主要集中在湖南、江西等地，為獲得對福建柑橘潰瘍病有較好防效的菌株，本研究擬從福建福州3個柑橘園采摘葉片、春稍和花進行分離篩選，并對其抑菌、防病作用及其分類學地位進行研究，為柑橘潰瘍病的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 福桔（8年生）、臍橙（6年生）和南豐蜜橘（3年生）于2011年4～5月份分別從福州閩侯南通鎮、福清漁溪鎮和東張鎮柑橘園采集。

1.1.2 供試菌株 柑橘潰瘍病菌（K5）Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac.）由本實驗室鑒定保存和枯草芽孢桿菌（BS168）Bacillus subtilis 由美國芽孢桿菌遺傳保藏中心（Bacillus Genetic Stock Center，BGSC）惠贈。

1.1.3 供試試劑 Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]、16S rDNA擴增的上游引物（27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCT

CAG-3′）和下游引物（1492R：5′-TACGGYTACCTT

GTTACGACTT-3′）[14]（上海生物工程技術服務有限公司）、Taq DNA聚合、dNTPS、10×PCR Buffer [寶生物工程（大連）有限公司]、瓊脂糖、TBE[15]、Biospin膠回收試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]、TaKaRa pMD 18-T Vector[寶生物工程（大連）有限公司]。

1.1.4 供試培養基[16] 柑橘細菌的分離和培養采用NA、NB培養基。

1.2 方法

1.2.1 柑橘組織細菌的分離 用清水將樣品（葉片、春稍、花）沖洗干凈，晾干；在無菌操作臺用無菌水漂洗3次，晾干后轉入滅菌過的研缽中，加適量無菌水研磨成漿（無菌水量沒過研磨漿為準），靜置30 min，取25、50、100 μL在NA培養基平板涂布。28 ℃恒溫箱中培養48～72 h，根據菌落形態、顏色等分別挑取不同類型單菌落，純化保存備用。

1.2.2 拮抗菌株的平板篩選 以柑橘潰瘍病菌為靶標菌，采用平板抑菌圈法篩選其中的拮抗菌株[17]。先把培養48 h的柑橘潰瘍病菌用無菌水配成懸浮液（OD600=0.5），然后將100 mL NA培養基融化并冷卻至45 ℃左右加入病原菌的懸浮液1 mL，倒好平板，吹干后在每個平板上等距離點接5株待測細菌，28 ℃恒溫箱中培養，并于48、72 h觀察抑菌情況，并測量其抑菌透明圈半徑。

1.2.3 分離細菌離體葉片防效的測定 參照李云鋒等[18]方法采摘無蟲無病的新抽出的功能葉（品種福桔），洗凈，晾干，每張葉片背面用滅菌大頭針預先針刺5個孔。本實驗共設3個處理，（1）先用滅菌濾紙沾70 μL的待測分離菌株培養液（28 ℃搖床培養2 d，濃度約為5×108 cfu/L）貼于葉片針刺傷口上，將葉片置于無菌培養皿中，底部濾紙用無菌水潤濕，然后將培養皿置于塑料盆中，套袋保濕，置28 ℃恒溫箱中培養24 h后，將原先的濾紙取下，在葉片針刺傷口處貼上沾70 μL的柑桔潰瘍病菌（OD600=1.0）的滅菌濾紙。（2）先用滅菌濾紙沾70 μL的清水，24 h后撕下并貼上沾有70 μL的柑橘潰瘍病原菌菌液（OD600=1.0）。（3）單接清水。每個處理重復3次，置于28 ℃恒溫箱中培養并定期觀察結果。

統計公式：發病率/%=（發病針孔數/總針孔數）×100；防治效果/%=[（病菌處理區發病率-生防菌處理區發病率）/病菌處理區發病率]×100

1.2.4 拮抗菌防效的測定 取1 mL拮抗菌菌株培養液（28 ℃搖床培養48 h，濃度約為5×108 cfu/L）12 000 r/min離心10 min，分別收集其菌體和上清液（即代謝產物），上清液用細菌過濾器（濾膜孔徑0.22 μm）過濾1次，菌體用無菌水清洗1次，再用1 mL無菌水配成菌體懸浮液，備用。接種方法、發病率和防治效果的統計方法同1.2.3。

1.2.5 拮抗菌胞外酶活性的測定 β-1，4-內切葡聚糖酶活性參照范曉靜等[19]方法測定；β-1，3-1，4-內切葡聚糖酶活性參照張秀艷等[20]方法測定；蛋白酶活性參照何召明等[21]的方法進行測定。

1.2.6 拮抗菌株的鑒定 （1）16S rDNA測序。拮抗菌株16S rDNA測序包括總DNA的提取、PCR擴增、連接轉化等，參照分子克隆第三版[15]的方法進行。將回收的16S rDNA 片段送到上海生物工程技術服務有限公司序列測定，對測序得到的基因序列利用GenBank中的BLAST軟件進行同源性分析，利用MEGA3.1軟件構建系統發育樹。

（2）形態特征和生理生化特性測定。革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢和晶體染色等形態學觀察參照方中達[16]的方法進行，而其運動性測定、接觸酶試驗、甲基紅和V-P試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解、明膠液化和吲哚試驗等生理生化測定參照東秀珠等[22]的方法進行。以枯草芽孢桿菌BS168為對照菌株。

2 結果與分析

2.1 柑橘細菌的分離純化與拮抗菌篩選

從福州地區3個橘園采集的福桔、臍橙、南豐蜜橘的葉片、春稍、花上共分離獲得84株細菌。其中從福桔上分離到的菌株最多，為39株；臍橙次之，為26株；南豐蜜橘最少，只有19株。

通過平板拮抗實驗，結果表明有11株菌株對柑橘潰瘍病菌具有不同程度的拮抗作用，占篩選菌株總數的13.1%（表1）。其中以菌株YH1對柑橘潰瘍病菌的拮抗效果最好，72 h抑菌帶半徑寬達4.5 mm。

2.2 離體葉片的防治效果

通過離體葉片對柑橘潰瘍病進行防治實驗測定，結果發現有60株細菌對離體葉片柑橘潰瘍病具有防治效果，占菌株總數的71.4%，防效大于50%的菌株有39株，占菌株總數的46.4%。對其中防效最好的7株菌株進行復篩（表2），結果發現接種處理10 d后，供試的7株菌株防治效果均在70%以上。接種處理14 d后，菌株YH1、YS5和NY20的防治效果最好，達90.9%～100%。對上述3株生防細菌的培養液（菌體+代謝產物）、菌體及其代謝產物分別進行防病效果測定（表3），供試菌株的菌體+代謝產物、菌體及其代謝產物均對柑橘離體葉片潰瘍病有一定的防效。不同菌株相同處理防效不同，以菌株YS5的防效最好；同一菌株不同處理的防效也不同，以菌體+代謝產物的防治效果最好，菌體次之，菌液的上清液即代謝產物的防治效果最差。生防菌處理的葉片即使每個針刺傷口都發病，但病斑明顯小，可見生防菌能有效地抑制病斑的生成和擴展。

2.3 拮抗細菌胞外酶活性

柑橘拮抗細菌胞外酶活性測定結果如表4。測定結果表明菌株YH1、YS5、NY20均具有蛋白酶活性和較高的β-1，4 -內切葡聚糖活性，但只有YH1菌株具有β-1，3-1，4-內切葡聚糖酶活性。

2.4 拮抗細菌16S rDNA鑒定

測序結果表明，拮抗菌株YH1、YS5和NY20 16S rDNA序列長度分別為1 471、1 474、1 474 bp。利用NCBI數據庫中的BLAST軟件分析結果表明，菌株YS5和NY20的16S rDNA序列與已知菌株B. cereus、B. anthracis、B. thuringiensis等的16S rDNA序列的同源性均在99%以上，YH1菌株的16S rDNA序列與已知菌株B. pumilus的16S rDNA序列的同源性99%以上，選取10株近緣種構建系統發育樹（圖1和圖2），可以看出菌株YS5和NY20可能為B. thuringiensis或B. cereus，而菌株YH1為B. pumilus。

2.5 生防細菌的常規測定

生防細菌于28 ℃在NA培養基上培養48 h， 菌株YS5與NY20菌落均呈灰白色、圓形或近圓形，邊緣不整齊，表面干燥、不透明。菌株YH1菌落呈乳白色，近圓形，邊緣整齊，較濕潤，不透明。在光學顯微鏡下，這3株生防細菌均為桿狀，革蘭氏染色陽性，周生鞭毛，產芽孢，芽孢橢圓形，在菌體中央生成，芽孢比菌體稍小。生理生化測定結果與對照菌株BS168的測定結果一致（表5）。根據形態特征和生理生化特征，同時結合16S rDNA鑒定結果，確定菌株YH1為短小芽孢桿菌（B. pumilus），YS5和NY20為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

3 討論與結論

本研究從3個柑橘品種不同組織上分離到84株細菌，室內平板拮抗篩選只獲得11株對柑橘潰瘍病菌具有拮抗效果的菌株，并且抑菌圈半徑大都很窄；而離體葉片防效實驗卻篩選到60株菌株對離體葉片柑橘潰瘍病具有防治效果生防細菌，其中39株菌株的防治效果大于50%。大部分菌株在平板上無抑菌作用，但對離體葉片潰瘍病具有一定的防效。這說明以室內平板拮抗活性作為指標篩選生防菌株具有一定的局限性。李云峰等[18]報告，離體葉接種與活體葉接種病原菌檢測水平一致，均為1.55×103-4 cfu/ml，而離體葉接種顯癥始期明顯早于活體葉接種，同一菌量條件下，發病率也高于活體葉接種。據此，本研究表明用離體葉片防病方法有利于篩選到在田間具有防效的生防菌。對生防細菌進一步防效實驗表明，生防菌的菌體+代謝產物防治效果最好，菌體次之，代謝產物最差，該結果說明生防細菌對柑橘潰瘍病的防治機制除了代謝產物外，還有菌體本身，生防菌株可能通過與病原菌在植物組織內競爭營養和空間，或通過誘導使植物產生抗病性等多種方式達到防治病害的目的[23]。

據報道，細菌胞外蛋白酶不僅與細菌生長的營養有關，而且也是細菌抵抗和侵襲其他病原菌的重要物質；而纖維素酶活性則有利于細菌分解環境中的纖維素而定殖[24-25]，本研究結果表明3株供試菌（YH1、YS5、NY20）具有較強的蛋白酶和纖維素酶（β-1，4 -內切葡聚糖酶）活性，說明3株生防菌株的防病機制可能與蛋白酶和纖維素酶活性有關。

本實驗通過室內平板篩選和離體葉片防病相結合的方法，獲得了3株對柑橘潰瘍病具有較好防治效果生防菌，經過鑒定，3株生防菌株均屬于芽孢桿菌屬，其中菌株YH1進一步鑒定為短小芽孢桿菌。但對這些菌株在田間的防病效果以及菌株YS5和NY20種的鑒定等均有待于進一步的研究。

參考文獻

[1] 劉 鵬， 易圖永， 安 然，等. 湖南省柑橘潰瘍病病菌生理生化特性初步研究[J]. 中國植保導刊， 2009（6）： 5-8.

[2] 段志坤， 廖運娥. 柑橘潰瘍病的發生及其綜合防控技術[J]. 植物醫院： 科學種養， 2013（4）： 31-32.

[3] 胡天其. 柑橘潰瘍病的發生與防治的研究綜述[J]. 世界農業，1988（7）： 30-32.

[4] Lan B T N， Christian V， Philippe J， et al. From local surveys to global surveillance： three high-throughput genotyping methods for epidemiological monitoring of Xanthomonas citri pv. citri Pathotypes[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2009， 75（4）： 1 173-1 184.

[5] Das A K. Citrus canker-A review[J]. Journal of Applied Horticulture， 2003， 5（1）： 52-60.

[6] 何秀玲， 袁紅旭. 柑橘潰瘍病防治措施的研究現狀[J]. 現代農業科技， 2007（15）： 80-81.

[7] 周吉奎， 羅 寬， 肖啟明. 柑橘潰瘍病生物防治研究[J]. 湖南農業大學學報（自然科學版）， 2001， 27（4）： 303-305 .

[8] 張洪波， 巢 進， 王躍強，等. 柑橘潰瘍病拮抗菌的分離篩選及其田間防效[J]. 湖南農業大學學報（自然科學版）， 2007， 33（5）： 605-607.

[9] 陳 力， 王中康， 黃冠軍， 等. 柑橘潰瘍病生防菌株CQBS03 的鑒定及其培養特性研究[J]. 中國農業科學， 2008， 41（8）： 2 537-2 545.

[10] 易 龍，馬冠華. 柑橘潰瘍病拮抗芽孢菌株的篩選及其控病作用[J]. 中國南方果樹， 2012， 41（4）： 5-7.

[11] 譚小艷， 黃思良， 任建國，等. 柑橘潰瘍病生防細菌Bt8的研究[J]. 微生物學報， 2006， 46（2）： 292-296.

[12] 譚小艷， 黃思良， 晏衛紅， 等. 柑橘潰瘍病菌的拮抗細菌Bv l0的研究[J]. 廣西農業生物科學， 2006， 25（3）： 229-234. [13] 譚小艷， 黃思良， 任建國，等. 柑橘潰瘍病內生拮抗細菌Bc51的研究[J]. 植物病理學報， 2007， 37（1）： 9-17.

[14] William G W， Susan M B， Dale A P， et a1. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacter-

iology， 1991， 173（2）： 697-703.

[15] Sambrook J， Russell D W. MolecuLar Cloning： A laboratory manual-3rd[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001.

[16] 方中達. 植病研究方法3版[M]. 北京：中國農業出版社， 1998：63-65， 179-181.

[17] 洪鵬翔， 邱思鑫， 陳 航， 等. 4種茄科作物內生細菌的分離及拮抗菌的篩選[J]. 福建農林大學學報： 自然科學版， 2007， 36（4）： 347-351.

[18] 李云鋒，李 祥. 柑橘潰瘍病菌離體葉接種檢驗法的研究[J]. 華中農業大學學報， 2000， 19（5）： 421-423.

[19] 范曉靜， 邱思鑫， 胡方平. 內生解淀粉芽孢桿菌TB2內切β-1，4 -葡聚糖酶基因的克隆和原核表達分析[J].熱帶作物學報，2008， 29（4）： 443-449.

[20] 張秀艷， 阮 暉， 傅明亮，等. 枯草芽胞桿菌ZJF-1A5的β-葡聚糖酶熱穩定性改造及酶學性質分析[J].農業生物技術學報，2007， 15（3）： 508-513.

[21] 何召明， 張義正，王海燕. 短小芽孢桿菌堿性蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌WB600中的表達[J].四川大學學報：自然科學版，2009（4）： 1 141-1 146.

[22] 東秀珠， 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京： 科學出版社， 2001： 364-384.

[23] Compant S， Duffy B， Nowak J， et al. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant disease： principle， mechanism of action， and future prospects[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2005， 71（9）： 4 951-4 959.

[24] 李瑞武， 陳懷青， 陸承平， 等. 細菌蛋白酶的致病作用[J]. 國外醫學微生物學分冊， 1998， 21（3）： 22-23.

[25] 夏振強， 暴增海， 周 超，等. 抗真菌海洋細菌Ll-9菌株的幾種胞外酶活性測定. 河南農業科學， 2009（7）： 74-77.