香蕉GAPDH基因家族的生物信息學及轉錄表達分析

史后蕊等

摘 要 從香蕉基因組數據庫和NCBI數據庫中檢索香蕉GAPDH基因家族的所有成員，并采用生物信息學方法對其進行亞細胞定位、進化樹分析和保守結構域預測。克隆測序發現，巴西蕉內的GAPDH基因家族成員序列與小果野蕉基因組數據庫中提供的序列基本一致，同源性超過98%。轉錄表達分析表明，GAPDH基因家族成員在巴西蕉不同器官的表達模式多樣：MaGAPCP1，MaGAPC6/8/10/11成組成型表達，其余的基因則在各組織器官間成差異型表達，且差異型表達的基因在不同組織器官中表達模式也不相同，組成型表達的基因在不同組織器官中表達模式雖相同，但表達量有差異。GAPDH基因家族成員在表達模式上的多樣化，可能暗示其功能的多樣化，這種多樣化可能是在進化過程中為適應環境而出現的功能分化或冗余。結果為進一步研究GAPDH基因家族成員在香蕉生長、發育，非生物脅迫，果實后熟等重要生物學過程中的功能奠定基礎。

關鍵詞 香蕉；GAPDH基因家族；生物信息學分析；表達分析

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

Bioinformatics and Expression Analysis of

Banana GAPDH Gene Family

SHI Hourui1，2， FENG Renjun2 *， WANG Jingyi2， CHAI Juan1，2， REN Mengyun1，2

LU Lifang2， ZHANG Yindong1 **

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，

Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）is one of the key enzymes involved in glycolysis， gluconeogenesis and the Calvin cycle， which is widespread in higher plants playing an important role in plant growth and development. In this study， their subcellular location， phylogenetic tree and conserved domains prediction of the GAPDH gene family members from NCBI database and banana genome database were performed by the bioinformatics method. And all the members were amplified，cloned and sequenced from Musa AAA（Cavendish subgroup cv.Brazil）， showing >98% sequence identity with Musa acuminata genome. The results showed that the expression patterns of GAPDH gene family members were diversity in different tissues of Musa AAA（Cavendish subgroup cv.Brazil）. MaGAPCP1 and MaGAPC6/8/10/11 were constitutive expression genes， while the others were differentially expressed in different tissues. Although the expression patterns of constitutive expression genes were same， there were differences in expression levels. The diversity on the expression patterns of GAPDH gene family members may imply their functional diversity. Such diversification of biological function may be functions differentiation or redundant occurred in the evolution of GAPDH gene family. These results will lay the foundation for further research on the functions of GAPDH gene family in growth and development， abiotic stress， fruit ripening and other important biological processes of banana.

Key words Banana； GAPDH gene family； Bioinformatics analysis； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.013

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehyrogenase，GAPDH）廣泛存在于高等植物中，是參與糖酵解、糖異生和卡爾文循環的一個關鍵酶，按其生化特性可分為磷酸化和非磷酸化兩大類。根據磷酸化的GAPDH在細胞中的不同定位可將其分為GAPC、GAPCp（EC 1.2.1.12）和GAPA/B（EC 1.2.1.13）三類。GAPC定位于細胞質中，其糖酵解和糖異生過程中氧化和磷酸化D-甘油醛3-磷酸（D-glyceraldehyde-3-phosphate）轉變成1，3-二磷酸甘油酸（1，3-diphosphoglycerate），同時將NAD+還原成NADH。GAPCp和GAPA/B都是質體型GAPDH，GAPCp主要存在于非綠色質體中，依賴于NAD+，其通過與磷酸甘油酸激酶（PGK）催化兩個連續的反應，形成 3-磷酸甘油酸和 ATP[1-2]。GAPA/B由GapA和GapB亞基組成， 位于葉綠體中，依賴于NADPH，參與卡爾文碳循環光合固定CO2[3]。非磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Nonphosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），簡稱為NP-GAPDH（EC 1.2.1.9），依賴于NADP+，在細胞中催化氧化甘油醛-3-磷酸轉變為3-磷酸甘油酸這一不可逆反應，同時產生NADPH。該酶是醛脫氫酶（ALDH）超家族中的一員，最新的研究將其歸為ALDH11家族[4]，其與磷酸化的甘油醛-3-磷酸脫氫酶在核酸與蛋白水平上沒有同源性。GAPDH在功能上與植物的生長發育密切相關，擬南芥GAPDH缺失突變體表現為植株矮小、根不能正常生長和花粉敗育[5-6]。抗逆性研究結果表明：過量表達GAPDH基因的水稻耐鹽性提高等[7]；小麥GAPDH蛋白受聚乙二醇、鹽和ABA誘導上調表達，受低溫誘導下調表達[8]。擬南芥幼苗在鎘元素脅迫下，根中胞質磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPC1和GAPC2產生應答，GAPC1在轉錄水平上比GAPC2更敏感[9]。

香蕉（Musa spp.）是世界上重要的水果之一，同時也是重要的糧食作物和經濟作物。除三倍體AAA、AAB、ABB外，還有二倍體AA、BB、AB，四倍體AAAA，AABB、AAAB，這使香蕉具有特殊的生物學特性和遺傳特性。二倍體小果野蕉（Musa acuminate）全基因組測序完成[10]，這為香蕉分子生物學研究的發展提供了良好的平臺。香蕉GAPDH受乙烯誘導、干旱脅迫時上調表達，并在維持NAD/NADH穩態中發揮重要作用。本研究在香蕉全基因組水平上對GAPDH基因家族進行分子進化和保守結構域分析，并取栽培品種巴西蕉為試驗材料，對香蕉GAPDH基因家族成員進行了轉錄表達分析，以期為進一步研究該家族在巴西蕉生長及形態發育，非生物脅迫，果實后熟等重要生物學過程中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為生長良好的巴西蕉植株，取自中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術研究所實驗基地。采集巴西蕉的根、葉、花、果，清洗后用液氮速凍，-80 ℃保存備用。

香蕉GAPDH基因家族的序列信息從香蕉基因組數據庫（http：//banana-genome.cirad.fr/）和NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行查找。擬南芥GAPDH基因及序列信息來自擬南芥數據庫（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）和NCBI數據庫。

1.2 方法

1.2.1 香蕉GAPDH基因家族生物信息學分析

通過檢索NCBI數據庫和香蕉基因組數據庫，搜索并獲取香蕉GAPDH基因序列信息。根據獲取的基因組信息，采用在線軟件INRA和PSPORT對香蕉GAPDH基因家族成員進行亞細胞定位預測（http：//urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html和http：//psort.hgc.jp/）。將檢索到香蕉GAPDH氨基酸序列與已知的GAPDH氨基酸序列進行比對分析，再對香蕉GAPDH進行分類。利用軟件MEGA 5.2對香蕉GAPDH蛋白的氨基酸序列與擬南芥和其它物種的GAPDH進行多重序列對比，具體方法為：刪除兩端未對齊的氨基酸序列，根據Neighbor-Joining法，并進行1 000次bootstrap統計學檢驗，構建GAPDH基因家族進化樹。利用DNAMAN軟件對香蕉GAPDH的蛋白多重序列進行比對，利用NCBI的CDD數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）對香蕉GAPDH蛋白進行結構域分析。

1.2.2 香蕉總RNA的提取及反轉錄 取-80 ℃保存的香蕉根、葉、花、七成熟果等組織，分別在液氮中充分研磨，采用改良CTAB法提取總RNA，利用凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和完整性。DNaseⅠ酶除去總RNA中的基因組DNA，按照Fermentas公司RerertAidTM Premium Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈，操作均按說明書進行。根據NCBI數據庫中香蕉Actin基因序列，設計檢測引物，見表1。通過PCR擴增香蕉的Actin基因，檢測反轉錄是否成功。

1.2.3 香蕉GAPDH基因家族的表達分析 對香蕉基因組數據庫中獲取的GAPDH基因家族成員序列設計PCR引物（表1），以巴西蕉RNA反轉錄得到的cDNA第一鏈為模板，克隆到目的片段，送生物公司測序，并將測序結果與基因組預測序列進行比對。以香蕉Actin為內參基因，以反轉錄得到的cDNA第一鏈為模板，采用半定量RT-PCR方法檢測GAPDH基因家族在巴西蕉不同組織器官中的表達情況，并根據內參β-actin亮度，調整cDNA模板的量，最終確定半定量RT-PCR的最優反應體系。

2 結果與分析

2.1 香蕉GAPDH基因家族的成員分布

通過在NCBI和香蕉基因組數據庫上對GAPDH基因的檢索、篩選，共獲得18個香蕉GAPDH基因家族成員，分布在香蕉第2、5、6、7、8、9、10、11號染色體和Un-random染色體上。其中有2個為編碼非磷酸化GAPDH的基因，將其命名為MaNP-GAPDH1和MaNP-GAPDH2；其余16個為編碼磷酸化GAPDH的基因。磷酸化的GAPDH分為GAPA/B，GAPCp和GAPC三類，通過與其他物種GAPDH氨基酸序列比對分析和在線亞細胞定位預測，其中4個定位于葉綠體的磷酸化GAPDH的編碼基因，分別命名為MaGAPA1、MaGAPA2、MaGAPB1和MaGAPB2；1個定位于非綠色質體的磷酸化GAPDH的編碼基因，命名為MaGAPCp1；11個定位于細胞質的磷酸化GAPDH的編碼基因，依次命名為MaGAPC1至MaGAPC11，詳見表2。

2.2 香蕉GAPDH的系統進化樹分析

擬南芥GAPDH和磷酸化的MaGAPDH蛋白氨基酸序列重建系統發育樹結果顯示（圖1-A）：磷酸化的香蕉GAPGH蛋白家族清晰地分為GAPC，GAPCp和GAPA/B三個主支，且功能相似的蛋白聚為一束，MaGAPC5、MaGAPC7-11和AtGAPC1、AtGAPC2處于相同分支，MaGAPCp1和AtGAPCp1、AtGAPCp2處于相同分支，MaGAPA1、MaGAPA2和AtGAPA1、AtGAPA2處于相同分支，MaGAPB1、MaGAPB2和AtGAPB處于相同分支。由圖1-A還發現，MaGAPC3/6和GAPCp類蛋白聚合在一起，說明在MaGAPC3/6的定位預測上可能不準確，其也可能定位在質體中，這有待進一步研究證明。

將非磷酸化的MaNP-GAPDH氨基酸序列和檢索到的擬南芥、苜蓿、水稻、烏拉爾圖小麥、節節麥中的NP-GAPDH氨基酸序列重建系統進化樹（圖1-B），發現MaNP-GAPDH和單子葉植物水稻、烏拉爾圖小麥、節節麥的NP-GAPDH處于同一分支，和苜蓿、擬南芥的NP-GAPDH分開聚類，根據進化遠近的關系推斷NP-GAPDH可能已經在單、雙子葉植物分化形成時進行了分化。

2.3 香蕉GAPDH的蛋白結構域分析

磷酸化MaGAPDH蛋白的多重序列比對結果顯示（圖2），香蕉中的GAPDH保守性主要表現在基因的下游，在上游的保守性較低。采用CDD對MaGAPDH基因家族可能含有的保守結構域進行了分析，發現磷酸化的MaGAPDH蛋白都存在著高度保守的Gp_dh_N和Gp_dh_C兩個結構域，圖中細線框中的區域為Gp_dh_N結構域，粗線框中的區域為Gp_dh_C結構域。非磷酸化的MaGAPDH蛋白都含有ALDH-F11結構域。香蕉GAPDH基因家族具體蛋白結構域詳見表3。

2.4 總RNA和反轉錄的質量分析

經瓊脂糖凝膠電泳檢測，所提取的香蕉根、葉、花、果總RNA的28S、18S條帶清晰、完整，說明RNA沒有出現降解。紫外分光光度計測得OD260/OD280的比值介于1.8～2.0，表明總RNA的純度較高，沒有糖、蛋白質等污染，可以用與反轉錄合成cDNA第一條鏈。用Actin對反轉錄產物進行PCR驗證（圖3），表明合成的cDNA第一條鏈質量良好，可以作為半定量RT-PCR的模板。

2.5 香蕉GAPDH基因家族組織器官特異性表達

通過目的片段測序發現，巴西蕉的GAPDH基因家族成員序列與香蕉基因組數據庫中提供的序列基本一致，同源性超過98%，其GAPDH基因家族成員與香蕉基因組數據庫預測的GAPDH基因家族成員相對應。香蕉GAPDH基因家族不同器官特異性表達分析結果顯示：MaGAPA1/2、MaGAPB1/2、MaGAPC3、MaNPGAPDH2在不同組織器官有明顯的表達特異性，其中MaGAPA1/A2、MaGAPB1/B2、MaNP-GAPDH2主要在葉和果中表達，并在葉中表達量最高，在根和花中不表達或表達量很低；MaGAPC3主要在果中高表達，在根和葉中低表達；MaGAPC5/9在葉、花、果中表達量較高，在根中表達量較低；MaGAPC7主要在花、果中表達，在根和葉中表達量很低；MaGAPC1在根和葉中表達量最高。MaGAPCp1、MaNP-GAPDH1、MaGAPC2/6/8/10/11在各組織器官中也是均有表達，并且表達水平基本一致。MaGAPC4在根、葉、花、果中均未檢測到表達。

3 討論

國外對植物GAPDH研究主要集中于GAPDH蛋白或基因在模式植物中的功能，涉及植物激素信號、糖代謝、蛋白互作、抗氧化和抗逆性等諸多方面。在擬南芥中，GAPDH與ABA信號途徑存在關聯，GAPDH的功能缺失會引起擬南芥突變體植株在生長發育、氣孔關閉和種子萌芽等方面對外源ABA不敏感，然而突變體中內源ABA含量正常[11]。非磷酸化的GAPDH廣泛參與多種信號途徑轉導的SnRK（蔗糖酵解型蛋白激酶）磷酸化，并失去其活性[12]。GAPDH還可通過與磷酸核酮糖激酶、葉綠體小蛋白CP12形成多蛋白復合體的形式調節光合作用的碳同化過程[13]。研究還發現，GAPDH能通過提高抗氧化相關酶的表達抑制活性氧的過多積累，從而提高植物的抗逆性[7，14]。此外，GAPDH還廣泛參與基因表達的轉錄后調控，它作用于核tRNA運輸、DNA復制與修復等過程，也參與調控組蛋白基因的表達、調節端粒結構、核膜融合和微管蛋白的活性等生物學過程[15-17]。

國內研究者分別從小麥、三七、西伯利亞蓼等十幾種植物中克隆了GAPDH基因，并對各自的基因序列做了相關分析[18-21]。結果表明，生理型雄性不育小麥發育過程中，不同發育期GAPDH表達量存在顯著差異﹐西伯利亞蓼經NaHCO3脅迫處理后，葉部PsGAPDH表達量減少，莖部隨脅迫時間增加表達量增加；PsGAPDH還能提高轉基因酵母的耐鹽性。

但是，目前國內外有關GAPDH蛋白或基因在香蕉中的研究很少。Vanhove等[22]利用蛋白質組學篩選香蕉抗旱品種時，發現干旱脅迫下GAPDH上調表達，并猜想其在維持NAD/ NADH穩態中發揮重要作用；本實驗室通過蛋白質組學研究發現，香蕉果皮中GAPDH受乙烯誘導上調表達[23]。本研究在前期研究的基礎上，在香蕉基因組數據庫中搜索香蕉的GAPDH家族成員，共搜索到18個香蕉GAPDH蛋白。對檢索到的18個香蕉GAPDH蛋白及其基因進行分析發現，MaGAPA1-2、MaGAPB1-2亞細胞定位于葉綠體中，說明MaGAPA1-2、MaGAPB1-2可能參與香蕉光合作用；MaGAPCp1，MaGAPC1-11亞細胞定位于質體或細胞質中。轉錄表達分析發現，GAPDH基因家族成員在香蕉不同器官的轉錄表達模式多樣（圖3），部分基因在各組織器官間成差異型表達，另一部分則成組成型表達。差異型表達的基因在不同組織器官間的表達模式都不相同，如MaGAPA1/A2、MaGAPB1/B2主要在香蕉的葉和果表達，在根和花非綠色部位基本不表達，這與閆洪波等對鴨梨GAPDH基因的研究結果一致[24]。MaGAPC類基因（MaGAPC1/3/5/7/9）在香蕉的根、葉、花、果都有表達，但表達量卻有明顯差異，這些MaGAPDH基因可能參與香蕉抗逆境脅迫、果實的淀粉積累和成熟等生物學過程。組成型表達的基因表達量雖在組織器官間沒有差異，但各個基因間的表達量卻不同，如MaGAPC8/10，這類GAPDH一般作為代謝的基礎酶類，在維持植物物質與能量代謝穩定方面有重要的調控作用，在各器官和植物不同發育時期都平穩表達[25]，這類GAPDH基因可作為候選內參基因。GAPDH基因家族成員在表達模式上的多樣化，意味著其在組織、器官甚至亞細胞水平上進行了功能的特性化或專化，進而在功能上也表現出多樣性。因此筆者推斷，GAPDH基因家族的多成員現象可能與其在進化過程中為適應環境而出現的功能分化或冗余有關。

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責任編輯：趙軍明