睪酮通過抑制Rab13表達影響支持細胞屏障通透性

宿文輝 孟曉娜 賈曉宇

摘 要：探討Rah13 GTPase對血睪屏障（blood testis barrier， BTB）通透性的調節機制。體外分離培養20d齡大鼠睪丸支持細胞，睪酮處理后測定跨上皮電阻（transepiihelial electrical resistance，TER）， FITC-鬼筆環肽染色分析F-actin分布，并采用Western印跡檢測Rad13在睪酮處理前后的表達變化；siRNA干擾培養支持細胞中Rab13的表達。Western印跡檢測沉默效果并檢測連接蛋白表達變化；TER測定Rab13沉默前后上皮屏障功能改變，F-actin染色分析Rah13沉默對肌動蛋白絲分布的影響。結果顯示，睪酮處理可使體外支持細胞屏障TER值升高.F-actin在膜下聚集增強，且Rab13在睪酮處理后表達量明顯降低；Rab13 siRNA處理不影響連接蛋白質的表達，但可引起F-actin在細胞連接處的分布增強，導致體外BTB屏障功能增強。表明Rab13可通過調節F-actin的排布影響體外BTB通透性。

關鍵詞：血睪屏障：支持細胞：Rabl3：肌動蛋白絲

中圖分類號：R339.2+I

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）06-0500-05

血睪屏障（blood-testis barrier， BTB）是睪丸中血管和曲細精管之間的物理屏障，是由曲細精管支持細胞（Sertoli cell）、血管內皮基膜、結締組織和曲細精管基膜組成的屏障結構。其中，支持細胞間的各種細胞連接，如緊密連接、縫隙連接和特化的黏著連接等，是構成BTB的主要結構基礎，創造了相對穩定的生精內環境，既為精原細胞的發育提供營養，又阻止細胞毒性物質進入管腔，防止精子與免疫系統接觸。構成BTB的各種細胞連接具有特征性的微絲束分布，這些肌動蛋白絲（F-actin）垂直于生精上皮內兩相鄰的支持細胞膜，使BTB的細胞連接較其他各種生理屏障具有更強的粘附力。

在生精細胞穿越生精上皮的過程及精子釋放入生精小管腔過程中，緊密連接復合體必須不斷地解聚和重新紺裝，這就需要相關的連接蛋白快速地在細胞膜進行內吞和再循環。Rab GTPase是一族相對分子質量為20～30 kD的GTP結合蛋白，屬于Ras超家族。Rab GTPase主要參與細胞內不同細胞器間的蛋白轉運、蛋白質的循環利用、內吞、胞吐等過程。我們在前期研究中已經驗證了 Rab13在大鼠睪丸紺織中的表達，并且發現Rab13的表達是隨著生精上皮周期的變化而變化；本研究利用體外BTB模型，即原代培養的大鼠睪丸支持細胞，進一步驗證Rab13在調節血睪屏障通透性過程中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

20 d雄性SD大鼠（40～50 g）山中國醫科大學實驗動物部提供。兔抗Rab13抗體購自Abcam公司（英國）；兔抗Occludin、兔抗ZO-l、小鼠抗β-catenin購自 Invitrogen（美國）：兔抗N-cadherin、山羊抗actin抗體、?？雇谩⑴？股窖騦gG均購自Santa Cruz公司（美國）：FITC-鬼筆環肽、DMEM培養基為Sigma公司（美國）產品；靶向干擾Rab13的小RNA及對照組小RNA購自GenePharma（中國）；ReboJuice轉染試劑購自Novasgen公司（美國）；Prolong Gold Antifade封片齊0pti-MEM購自In-vitrogen公司（美國）；ECL顯色試劑盒購自Tnermo公司（美國）；PVDF膜為Millipore公司（美國）產品；其他常規試劑均為Sigma公司（美國）產品。

1.2 主要儀器設備

細胞培養板和transwell培養板為CorningCostar公司（美國）產品；熒光倒置顯微鏡為Olvmpus公司（日本）產品；臺式低溫超速離心機購自Sigma公司（美國）；數字電阻儀購自上海加佳電子儀表廠（中國）；電泳儀、電泳槽均購自Bio-Rad公司（瑞典）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠支持細胞原代培養

按本實驗室常規方法分離培養大鼠支持細，胞。取出生20 d雄性SD大鼠睪丸，去被膜，在DMRM培養基中剪碎至1 mm3用胰蛋白酶、膠原酶、透明質酸酶依次在37℃進行消化，消化產物經多次低速離心（<700 g）后接種于涂有 Matrigel的培養平板（0.5×10 6/cm2）、雙室模型（1.2×10 6/cm2）或蓋玻片（置于培養板中，0.05xlO 6/cm2）中，于35℃、5%C02培養箱中進行培養，每日更換無血清DMEM培養液（含表皮生長因子、轉鐵蛋白、胰島素及桿菌肽等營養因子）。培養48 h后，用20 mmol/LTris （pH 7.4）對培養細胞進行低滲處理以上除混雜的生精細胞。該方法分離培養的睪丸支持細胞純度可達98%，極少有各級生精細胞、肌樣細胞和Leydig細胞的污染。

1.3.2 跨上皮電阻（TER）測定

在雙室培養皿上層接種的支持細胞，于培養1～7 d每日用數字電阻儀（DT-9208，上海）測量并記錄TER值，以反映上皮細胞間緊密連接的功能。

1.3.3 睪酮處理培養細胞

為檢測Rab13在睪酮增強支持細胞上皮功能過程中的作用，于培養第4 d用睪酮（0.2 moI/L）處理支持細胞，每日測定TER值，并于處理后不同時間點檢測睪酬處理組Rab13的表達量及F-actin的分布。

1.3.4 F-actin染色

培養第6d，4%多聚甲醛于室溫固定接種于蓋玻片上的支持細胞10 min， O.l% Triton X-100通透處理4 min，隨后用含FITC-鬼筆環肽（l：150）的l%BSA避光室溫孵育1 h，Prolong gold antifade封片劑（含DAPI）封片.Olympus BX60熒光顯微鏡下觀察記錄結果。

1.3.5 免疫印跡

NP-40裂解液（50 mmol/L Tris、150 mmol/LNaCl、2 mmol/L EGTA、lO% glycerol、l%， NonidetP-40、pH 8.0）處理睪丸或體外培養Sertoli細胞，提取總蛋白，BCA定量法測定蛋白濃度后制備蛋白樣品。不同處理組蛋白（30 μg）經SDS-PAGE電泳后，轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，依次經一抗、二抗孵育后進行ECL顯影，Scion Image軟件掃描。β-actin做為蛋白內參照。

1.3.6 siRNA轉染

由上海GenePhama公司合成大鼠Rab13 siR-NAs，預實驗確定干擾效果。所用序列如下：Rab13 siRNA，5-CAUCJUAAGUGCUCUUGAAGtt-3，5'-CUUCAACAGCACUUACACCtt-3'；對照組sjRNA，5 -AGGAGAUGJUGAUAUUGGCUtt-3 ，5 -AGCCAAUAUCACAUCUCCUtt-3。BLAST排除與其他基因序列的同源性。于培養第4d進行siRNA轉染：在Opti-MEM中混勻siRNA及Re-boJuice轉染試劑，根據預實驗及培養密度確定siRNA濃度（TER測定實驗150 nmol/L， Western及細胞染色100 nmol/L）：轉染24 h后更換正常無血清培養液，繼續培養48 h后收集細胞。

1.3.7 統計學分析

本研究中所涉及TER及Western印跡等實驗結果采用GB-STAT分析軟件（版本7.0； Dy-namlc microsystems）進行雙因素方差分析及Dun-nett's檢驗，P<0.05為差異顯著，P

2 結果

2.1 Rab13參與睪酮對體外BTB屏障功能的調節

體外分離大鼠支持細胞，于雙室培養系統中培養，建立體外BTB模型，培養l～7 d測定跨上皮電阻（TER），結果顯示在培養第4 d TER值達到最高（圖1A）。于培養第4d用睪酮（0.2 mol/L）處理，TER測定顯示睪酮可以顯著提高支持細胞屏障功能（圖1A）； F-actin染色顯示，睪酮處理組肌動蛋白絲在細胞皮質處的分布增強（圖1 B）； Western印跡檢測睪酮組Rab13的表達在處理后12～48 h與對照組相比明顯下降（圖IC、D），提示睪酮可能通過調節Rahl3的表達影響支持細胞上皮通透性，即Rabl3參與調節體外BTB屏障功能。

2.2 體外siRNA干擾支持細胞Rab13的表達

為確定睪酬處理后支持細胞上皮通透性變化與Rab13表達量變化之間的關系.于培養第4 d在Sertoli細胞中通過siRNA干擾Rab13的表達24 h。繼續培養48 h后，Western印跡顯示Rab13表達量經干擾后與對照組相比可降低至70%，且對上皮屏障功能相關的緊密連接蛋白 （occludin、ZO一1）及粘附連接蛋白（N -cadherin、β-Catenin）的表達無靶外效應.即Rab13沉默并未引起連接蛋白的表達量變化。

2.3 Rab13 siRNA通過影響F-actin分布調節支持細胞屏障功能

siRNA干擾沉默支持細胞Rab13表達后，TER測定結果顯示Rab13 siRNA處理組細胞的屏障功能明顯高于對照siRNA處理組（圖3A）；F—actin染色亦發現Rab13沉默可引起與睪酮處理后相類似的改變，即F-actin在支持細胞膜下的聚集（圖3B）。這些結果表明，Rab13可通過影響F-actin在支持細胞中的排布影響體外BTB上皮的通透性。

3 討論

精子發生過程依賴于穩定的生精內環境，BTB使循環系統中的有害物質被支持細胞的連接復合體阻擋而不能進入生精上皮內的近腔小室.保證了其中精母細胞的減數分裂和精子變態在穩定的微環境進行。BTB中，支持細胞緊密連接處的細胞膜與膜下內質網池之間有大量平行排列的微絲束，這些微絲束與生精上皮周期中連接復合體組成蛋白的組裝和解聚密切相關。肌動蛋白結合蛋白（aCtin-binding protein，ABP），如Eps8 、Arp3、drebrin E、filamin A等，可以通過調節F-actin在支持細胞中的分布影響BTB中連接復合體的組裝，進而影響血睪屏障周期進程及精子發生過程。

在研究上皮細胞的緊密連接組裝的過程中，人們發現了多種Rab GTPase在連接復合體中的定位，并發現有多種Rab GTPase參與調節緊密連接的動力學變化。例如：Rab3B在PC12細胞中的過表達可以引起ZO-l的定位變化和肌動蛋白絲的重新組織，Rabl0在MDCK細胞胞內物質轉運過程中發揮作用。目前，對睪丸中Rab GTPase的研究還很少，其中，Rab8B被證明在睪丸支持細胞中可以與E-cadherin以及γ-catenin等連接復合體分子發生免疫共沉，Rab4A也被證明通過與catenin相互作用參與支持細胞與生精細胞間粘附連接的解聚過程。在前期研究中，我們檢測了Rab13在大鼠睪丸中的表達分布，發現Rab13在生精小管內的分布隨生精上皮周期的變化而變化，為進一步闡明Rab13在生精上皮屏障中的作用，我們在本研究中采用體外分離培養的大鼠睪丸支持細胞，建立體外BTB研究模型。在該模型培養條件下，TER測定顯示支持細胞間建立了功能性的緊密連接屏障，電鏡下具有緊密連接、縫隙連接、橋粒、基底特化的粘著連接等體內BTB的特征性結構，即可以模擬體內BTB進行功能性研究。

由于已知睪酮可以加強支持細胞BTB的屏障功能，我們存本研究中用睪酮處理培養的支持細胞，建立緊密連接屏障增強的體外BTB模型與以往研究結果一致，TFR測定結果顯示睪酮處理可顯著提高體外BTB的完整性，且F-actin染色亦顯示睪酮處理后F-actin在細胞膜下分布增多；進一步免疫印跡檢測Rab13的表達，結果發現在睪酮處理支持細胞12 h后，Rab13的蛋白水平開始下降，提示Rab13可能參與BTB的完整性調節。

為明確Rab13對BTB功能的影響，我們采用siRNA 干擾沉默培養支持細胞中Rab13的表達，結果顯示Rab13的蛋白表達水平可沉默至對照組的30%左右.此時緊密連接蛋白occludin、ZO-l及粘著連接蛋白N-cadherin、β-Catenin的蛋白水平均未發生明顯改變，即Rab13沉默對連接蛋白的表達量無影響。而TER測定顯示Rab13siRNA處理24 h后，體外BTB的屏障功能顯著提高；進一步F-actin染色，結果顯示Rab13表達受到干擾后，F-actin與睪酮處理后相類似，即在細胞皮質處的分布顯著增強。以上結果說明，Rab13 可通過調節F-actin在細胞連接處的排布，而不是連接蛋白質的表達，來影響睪丸支持細胞屏障的通透性，而這種影響亦參與睪酮對BTB完整性的調控過程中。研究表明，睪酮可以通過調節支持細胞膜連接蛋白的循環利用，并且通過影響肌動蛋白調節蛋白的功能，加強細胞連接處的肌動蛋白絲的分布并增強BTB完整性。在本研究中，支持細胞經睪酮處理后，F-actin在膜下聚集強度明顯強于Rab13被沉默后F-actin在膜下聚集強度.說明Rab13不是睪酮起作用的唯一途徑.而Rab13與其他參與睪酮作用的因素之間是否存在相互作用，還需進一步研究確定。