吲哚丁酸的體外抗氧化活性研究

沈雁等

摘 要 研究吲哚丁酸的體外抗氧化活性，包括DPPH自由基、羥基自由基和過氧化氫的清除能力，以及金屬螯合活性和還原力。結果表明，吲哚丁酸具有顯著的抗氧化活性，且與吲哚乙酸相當，其對DPPH自由基和羥自由基清除作用、螯合力、還原能力均高于萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸，而對Fe2+的絡合能力與沒食子酸無顯著差異。

關鍵詞 吲哚丁酸；抗氧化；自由基

中圖分類號 Q946；Q945 文獻標識碼 A

Antioxidant Activity of Indole-3-butyric Acid

SHEN Yan1， 2， CHEN Weijun4， ZHANG Tao3 ， JIANG Xuefei1， 2

LI Xinguo1， 2 *， LI Shaopeng1， 2， SONG Xiqiang1， 2

1 Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources， Ministry of

Education， Haikou， Hainan 570228， China

2 College of Horticulture and Landscape， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Food Science and Technique， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

4 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract The antioxidant activity of indole-3-butyric acid was studied by measuring the DPPH scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity， hydrogen peroxide scavenging activity， metal chelating activity and reducing power. The results showed that both IBA and IAA expressed a stronger antioxidant activity than NAA and 2，4-D in the DPPH scavenging activity， hydroxyl radical scavenging activity， metal chelating activity， reducing power. Compared with GA， no significant difference in metal chelating activity was appeared.

Key words Indole-3-butyric acid； Antioxidant； Free radical

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.019

吲哚（Indole）是吡咯和苯并聯的化合物，分子內含有亞胺基，許多具有抗癌[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]藥理功能的物質都來源于吲哚類衍生物，通常由吲哚環作為基礎結構合成。近年來，吲哚類衍生物的生理活性和其活性機理被大量地研究和開發[4]，其中最受青睞的就是這類物質的抗氧化作用。吲哚類衍生物可以通過清除自由基從而阻止糖類和脂質發生氧化，其清除能力主要是由吲哚環上的氮原子提供，被稱作是吲哚類衍生物的“活性還原中心”[5-7]。

吲哚丁酸（Indole-3-butyric acid，IBA）作為一類含有吲哚環結構的植物激素，能夠抑制根的伸長生長，進而促進側根原基的發生，在根的頂端優勢的調控中起著十分重要的作用[8-10]；但是目前對其促進生根的機理研究仍不明確。由于吲哚類衍生物本身具有的潛在的抗氧化作用，因此，吲哚丁酸可能是通過其抗氧化作用調控植物體內的氧化還原平衡，從而達到對植物體氧化脅迫的保護作用。為了驗證這一猜測，筆者研究了IBA體外對DPPH自由基、羥基自由基、過氧化氫的清除能力，以及對二價鐵離子的絡合能力，并同其他的激素做了比較，以期為后續的研究提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 UV-1200紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；SL-N型分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；PYX-DHG-9101型電熱恒溫鼓風干燥箱（廣東韶關科力實驗儀器有限公司）；HH-6型數顯恒溫水浴鍋（上海康儀有限公司）；CQ-10超聲波清洗器（寧波海矚五方超聲設備有限公司）；Heraeus Multifuge XIR高速離心機（Thermo scientific）。

1.1.2 主要試劑 2-脫氧核糖、抗壞血酸、DPPH、Ferrozine鐵試劑、硫代巴比妥酸、鐵氰化鉀皆購于美國SIGMA公司；其他藥品均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 DPPH自由基清除試驗 依據Blois方法測定DPPH自由基清除能力[11]。將2 mL 4 mmol/L的不同樣品溶液加入到2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液中。置于避光條件下反應30 min后，測定各混合溶液在517 nm處的光吸收值，較低的吸收值意味著高效的DPPH自由基清除能力。

DPPH自由基的清除率=（1-A樣品/A模型）×100%

1.2.2 還原能力的測定 根據Oyaizur的方法[12]，并進行改進。移取1 mL 1 mmol/L的各樣品溶液于試管中，加入2.5 mL 0.2 mol/L，pH6.6的磷酸緩沖液和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合后于50 ℃水浴20 min后，再加入10%三氯乙酸1 mL，3 500 r/min常溫離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻后在700 nm處比色。

1.2.3 羥基自由基的清除試驗 根據Elizabeth方法[13]，略加改進。在225 μL 0.1 mmol/L，pH7.4磷酸緩沖液中加入10 mmol/L脫氧核糖溶液125 μL，10 mmol/L過氧化氫溶液50 μL，25 μL 10 mmol/L的三氯化鐵溶液，10 mmol/L EDTA溶液25 μL和4 mmol/L的樣品溶液0.1 mL。通過添加0.03 mL 10 mmol/L的抗壞血酸引發反應，37 ℃水浴1 h，加入1%硫代巴比妥酸0.25 mL和2.8%三氯乙酸0.25 mL。90 ℃下水浴15 min，冷卻后在532 nm處測光吸收值。

羥基自由基的清除率=（1-A樣品/A模型）×100%

1.2.4 清除過氧化氫能力試驗 根據Wettasinghe方法[14]。用磷酸緩沖液（pH7.4）配制43 mmol/L的過氧化氫溶液。使其在230 nm處的摩爾吸收系數為81 mol/（L·cm）。取1 mL 1 mmol/L不同樣品溶液加入到2 mL過氧化氫溶液中。反應10 min后測定其在230 nm的光吸收值，以不含過氧化氫溶液的試樣作為對照組。

1.2.5 Fe2+絡合能力測定 參考Yen Gow-Chin方法[15]。移取2 mL 0.4 mmol/L樣品于試管中，加入1 mmol/L FeSO4溶液0.4 mL和5 mmol/L的Ferrozine鐵試劑溶液0.8 mL，室溫下反應10 min后，再加入1 mL無水乙醇。在562 nm處測吸光率。

Fe2+絡合率=（1-A樣品-A模型）×100%

1.3 數據統計分析

所有數據用SPSS20軟件處理，差異顯著性水平為α=0.05，多重比較使用單因素方差分析（ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基清除作用

DPPH自由基是一種穩定的以氮為中心的自由基，在517 nm波長處有最大吸收，通過此波長下吸光值的減少可表征抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力[16]。由圖1可知，5種樣品清除DPPH自由基的活性，其中GA、IAA和IBA表現出顯著清除DPPH自由基的能力，清除率分別為95.51%、45.42%和28.67%。雖然IAA和IBA的DPPH自由基清除活性均顯著低于GA，但均顯著高于2，4-D（6.34%）和NAA（8.43%），同時2，4-D和NAA兩者對DPPH的清除率之間差異不明顯（p>0.05）。

2.2 還原力的測定

還原力的大小是評判分子抗氧化能力的主要指標之一。圖2顯示的5個樣品的還原能力，較高的吸光度顯示較強的還原能力。GA和IBA、NAA的乙醇溶液測定有較高的還原力，它們之間表現出顯著的差異（p<0.01）。IBA吸光值為0.280，還原能力居中，與IAA無顯著差異。

2.3 測定羥基自由基的清除作用

通過抑制脫氧核糖降解測定樣品對羥基自由基的清除活性，過氧化氫和Fe2+反應形成羥基自由基，隨后攻擊脫氧核糖導致其降解為一系列片段脫氧核糖。一些或所有的脫氧核糖片段，在較低的pH值下與硫代巴比妥酸反應形成粉紅色的物質。從圖3可知，IBA的清除率為91.33%，是幾個樣品中羥基自由基的清除活性最高值，其次是IAA，二者間差異并不顯著。GA的清除率最低。

2.4 過氧化氫的清除作用

過氧化氫具有穿透生物膜的能力，同時在其他自由基形成過程中作為一個中介生產更多的活性氧分子。從圖4可以看出，IBA具有很強的清除過氧化氫的能力，清除率高達93.29%，其次是GA和IAA，NAA的清除能力則最小。

2.5 金屬Fe2+絡合活性的測定

金屬離子在自由基產生過程中起著重要作用，抗氧化劑通過絡合金屬離子而減少活性氧自由基的產生。從圖5可以看出，5種物質的金屬絡合活性不強，其中NAA和2，4-D基本沒有絡合活性，對Fe2+的絡合率分別為2.18%和2.51%。而IAA、IBA和GA雖然表現出相對較強的絡合作用，但是仍低于10%；此外IBA（8.21%）和GA（8.37%）之間無顯著差異性（p>0.05）。

3 討論與結論

筆者采用不同的自由基體系研究了IBA分子本身的抗氧化能力。天然產物抗氧化分子機理主要有H轉移機制[17-18]、電子轉移機制[19-21]和金屬絡合機制[22-23]。本研究對于DPPH自由基、羥基自由基、過氧化氫的清除活性評價主要是從H轉移機制方面考慮，還原力和絡合能力則分別是從電子轉移機制和金屬絡合機制方面研究IBA可能具有的抗氧化活性。從以上結果可以看出，在活性氧清除方面，IBA對于DPPH自由基、羥基自由基、過氧化物的清除能力較為突出，明顯高于NAA和2，4-D。IAA在DPPH自由基和過氧化氫清除能力方面略高于IBA，這主要是由于其分子中的烷基鏈影響的結果。眾多的研究證明烷基鏈的長短對其分子的抗氧化有較大影響，主要原因是通過改善分子的電子布局和疏水性實現的[24]。對還原力和金屬絡合作用的研究發現IBA和IAA活性間差異不顯著，這也說明其烷基鏈對它們的影響不明顯。

GA的抗氧化活性已被系統研究[25]，它常用來做評價其他天然產物活性大小的標準品之一[26-28]。本研究的結果可以看出，在活性氧清除和絡合能力方面，IBA的能力均略高或接近于GA，而在還原力方面低于GA。GA的抗氧化機制已經確認為其分子中的羥基進行H轉移所致[29]。由此可以判斷，IBA的抗氧化活性機制與H轉移和絡合有關。酸類抗氧化劑的金屬絡合主要和它的臨位羥基和羰基有關[30]，因此可以推測IBA對金屬的絡合主要是通過羰基實現的，但關于IBA的H轉移發生的具體位點目前還不清楚，一般認為可能會來源于與-NH中的H，也有可能來自-COOH的氫，具體的發生位點尚需下一步的研究。

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責任編輯：沈德發