松針提取物對導致蘋果腐敗的細菌的抑制作用研究

賀瑩 馮彩平 杭偉等

摘要[目的]研究從松針中提取的蹂質物質對蘋果滋生的細菌的抑菌作用。[方法]分別利用水提取法和醇提取法提取出松針中的抑菌物質，并研究其對蘋果中腐敗細菌的抑菌性。[結果]試驗表明，松針乙醇提取物與水提取物對蘋果中革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌均有抑菌效果，而且乙醇提取物對蘋果中革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌的抑菌作用要強于水提取物。[結論]研究可為蘋果的防腐保鮮提供技術參數依據。

關鍵詞蘋果；松針；抑菌

中圖分類號S661.1；Q935文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07986-02

基金項目山西省基礎研究計劃項目。

作者簡介賀瑩（1984- ），男，山西臨縣人，助教，碩士，從事發酵工程與代謝研究。

收稿日期20140703近年來隨著人們對健康的追求，綠色無公害的水果越來越受到人們的青睞。蘋果作為北方最常見的水果之一，因其價格適中、營養豐富而倍受大家喜愛，但由于保鮮不到位易造成腐爛變質而造成大量浪費， 食品防腐保鮮始終是一個待解決的重要問題[1]。隨著人們對化學防腐劑潛在的安全問題的認識逐步深入，安全、高效、無毒的天然防腐劑成為食品學科研究的熱點。由化學合成的保鮮劑又因食品安全等問題為人們所詬病，因此研究天然的蘋果保鮮劑不但有利于蘋果的保鮮還有利于健康飲食[2]。

研究表明，松針中含有大量揮發油、色素、纖維素、氨基酸、黃酮等化合物[3-4]，此外還含有鈣、磷、鐵、錳等多種微量元素。松針中含有大量的蹂質，國內外學者對蹂質的研究表明，蹂質在抑制脂質過氧化、心血管病、抗衰老、抗癌等方面有獨到功效[5-7]。 秋季采摘下來的新鮮蘋果在貯藏期間會發生生理病害和真菌病害，導致蘋果腐爛而失去食用價值，由此造成的經濟損失巨大[8]。據統計，在發達國家每年有10%～30%的新鮮蘋果損失于采后腐爛，而在缺乏貯運冷藏設備的發展中國家，其腐爛損失量則高達 40%～50%[9]。

筆者將分別利用水提取法和醇提取法提取出松針中的抑菌物質并對其抑菌性做研究，以達到利用天然物質進行抑制細菌生長的目的。同時，探討松針水提取物的抑菌作用，可為其在食品防腐保鮮中的應用提供可靠的技術參數。

1材料與方法

1.1材料原材料：市售蘋果、馬尾松松針（校園采集）。主要試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、蒸餾水、瓊脂、生理鹽水、95%乙醇、乳糖、磷酸氫二鉀、2%伊紅水溶液、0.5%美藍水溶液、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、膽鹽、結晶紫、中性紅、蛋白胨、牛肉膏粉末、D甘露醇、酚紅。主要儀器與設備：培養皿、試管、蠟筆、玻璃棒、膠頭滴管、pH試紙、移液槍、酒精燈、涂布棒、三角瓶、手術刀、天平（AR1140，江門市東信儀器服務有限公司）、粉碎機、滅菌鍋、旋轉蒸發儀、恒溫培養箱（BSP250生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、真空干燥機、恒溫搖床培養箱。

1.2菌種的篩選

1.2.1培養基的制備[10]。營養瓊脂培養基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，氯化鈉 0.5 g，瓊脂 1.5 g，蒸餾水100 ml。伊紅美藍培養基[11-13]：蛋白胨10 g、乳糖10 g、磷酸氫二鉀2 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 ml、2%伊紅水溶液20 ml 、0.5%美藍水溶液13 ml。

1.2.2腐爛蘋果中優勢菌的分離。

1.2.2.1樣品來源及處理。樣品來源于呂梁超市，一經買回不經過任何處理就放在自然通風處讓其自身發生病變腐爛，以便后用。

1.2.2.2試驗方法。涂布培養：在生物潔凈工作臺上取蘋果腐爛部分25 g絞碎，放在225 ml無菌生理鹽水中，在搖床中振蕩30 min，然后取1 ml上清液進行梯度濃度稀釋，每個稀釋度做3個重復，傾倒在營養瓊脂培養基培養，放到37 ℃培養箱中倒扣培養48 h。

1.2.3菌種初步鑒定。菌落觀察。觀察平板的菌落邊緣，形狀，光澤，干濕潤，粗糙光滑，顏色等特征。革蘭氏染色：按革蘭氏染色步驟進行染色。

1.3松針有效成分的提取試驗

1.3.1馬尾松針預處理。馬尾松針清洗后，于50 ℃熱風干燥，粉碎，備用。將采集的松針老葉、幼葉等量混合，洗凈，于35 ℃ 熱風干燥，待松針呈干脆狀后，用粉碎機打成粉，備用。選擇松針老葉、幼葉，分別按上述處理，得松針老葉粉與幼葉粉，備用。

1.3.2松針水提物的制備[14]。取50 g松針粉，置于燒杯中，加入1 000 ml蒸餾水浸泡24 h，浸泡液過濾，將濾液在60 ℃條件下旋轉蒸發，濃縮至50 ml。在4 ℃，10 000 r/min的條件下，將濃縮液冷凍離心30 min，取上清液。所得液體于20 ℃ 靜置過夜，重復上述冷凍離心操作，取上清液，即制得松針水提物。將水提取物放入燒杯中，放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥，得到黏稠狀物質，制成松針水提取物編號為A。取10 g該物，用蒸餾水配制成1 000 g/L的溶液，備用。

1.3.3松針醇提物的制備[15]。取50 g松針粉，置于燒杯中，加入1 000 ml 75%乙醇溶液浸泡24 h，將浸泡液過濾，取濾液。將濾液在40 ℃條件下旋轉蒸發，濃縮至50 ml，在40 ℃， 10 000 r/min的條件下，將濃縮液冷凍離心30 min，取上清液。所得液體于20 ℃靜置過夜，重復上述冷凍離心操作，取上清液，即制得松針醇提物。將醇提取物放入燒杯中，放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥，制成松針醇提取物編號為B。取10 g該物，用蒸餾水配制成1 000 g/L的溶液，備用。

1.4松針提取物對不同細菌的抑菌效果試驗

1.4.1供試菌株懸浮液的制備。將上述從腐爛蘋果中篩選的p1、p2菌分別接種于營養瓊脂培養基中，37 ℃恒溫培養24 h，用接種環挑取已進行菌種斜面活化的培養基表面的菌塊，加入盛放無菌生理鹽水的三角瓶中振蕩均勻[16]。

1.4.2不同濃度抑菌液的制備。分別將松針水提取物按1∶10、1∶100的等比例稀釋得到濃度為1 000、100、10 g/L的提取物液。用同樣的方法得到濃度為1 000、100、10 g/L的松針醇提取物液。

1.4.3抑菌試驗。采用濾紙片法，將直徑5 mm的濾紙圓片經高壓滅菌處理后干燥，分別滴加20 μl上述6種不同溶劑的提取液作為試驗樣片以抑菌液命名紙片，滴加蒸餾水作為陰性對照。

準備7個營養瓊脂培養基，用移液槍移取p1菌懸菌液均勻涂布培養基表面，制成含菌平板，稍干后用無菌鑷子將6片試驗樣片和1片對照樣片貼放于每個培養皿的表面，蓋好培養皿，放入恒溫培養箱中37 ℃培養24 h[16]，測量抑菌圈直徑。準備7個營養瓊脂培養基，用移液槍移取p2菌懸菌液均勻涂布培養基表面，制成含菌平板，余下步驟同上，最后測量抑菌圈直徑。

2結果與分析

色結果p1整齊圓形有光澤不透明桿菌陰性p2整齊圓形有光澤不透明球菌陽性

2.2馬尾松針乙醇提取物和水提取物對p1菌的抑制作用

2.2.1水提取物對p1菌的抑制作用。試驗得出，馬尾松針水提物濃度為1 000、100、10、0 g/L時，其對p1菌的抑菌圈直徑依次為15、7、0、0 mm。由此可以看出，馬尾松針水提取物濃度越高，對p1菌抑菌效果越強，濃度為10 g/L時，沒有抑菌作用。

2.2.2醇提取物對p1菌的抑制作用。試驗得出，馬尾松針醇提物濃度為1 000、100、10、0 g/L時，其對p1菌的抑菌圈直徑依次為20、10、3、0 mm。由此可以看出，馬尾松針醇提取物濃度越高，對p1抑菌效果越強，濃度為10 g/L時，仍有抑菌作用。從以上試驗結果得出，在相同濃度下，馬尾松針醇提取物對p1菌的抑菌效果好于水提取物。

2.3馬尾松針乙醇提取物和水提取物對p2菌抑制作用

2.3.1水提取物對p2菌的抑制作用。試驗得出，馬尾松針水提物濃度為1 000、100、10、0 g/L時，其對p2菌的抑菌圈直徑依次為14、8、0、0 mm。由此可以看出，馬尾松針水提取物濃度越高，對p2菌抑菌效果越強，當濃度低到10 g/L時，沒有抑菌作用。

2.3.2醇提取物對p2菌的抑制作用。試驗得出，馬尾松針醇提物濃度為1 000、100、10、0 g/L時，其對p2菌的抑菌圈直徑依次為21、12、2、0 mm。由此可以看出，馬尾松針醇提取物濃度越高，對p2抑菌效果越強，濃度為10 g/L，仍有抑菌作用。以上試驗結果得出，在相同濃度下，馬尾松針醇提取物對p2菌的抑菌效果好于水提取物。

3結論

研究得出，馬尾松針乙醇提取物與水提取物對蘋果中革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌均有抑菌效果，而且乙醇提取物對蘋果中革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌的抑菌作用要強于水提取物，這可能是因為抗菌活性高的成分更容易溶于乙醇。該法提取的抗菌活性物質，在很低的濃度下，仍有抗菌活性。建議今后可以采用醇提法提取馬尾松針抗菌活性物質，應用到蘋果的防腐保鮮中。

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