熱辣2號辣椒純度鑒定及優良自交系遺傳多樣性分析

劉子記　楊衍　孫繼華等

摘 要 為了提高種子質量和充分利用辣椒種質資源，應用SSR分子標記對熱辣2號雜交種純度進行鑒定并對部分辣椒優良自交系進行遺傳多樣性分析。以熱辣2號母本材料CAYB02和父本材料CAYB01為模板篩選85對辣椒SSR引物，其中12對引物在親本間能擴增出明顯的多態性，多態性比率為14.12%，多態性標記分別位于辣椒1、3、4、6、7、9、11、12號染色體，利用3對位于不同染色體上的SSR標記對熱辣2號黃燈籠椒雜交種的純度進行鑒定，熱辣2號種子純度為98.79%，標記鑒定結果與田間鑒定結果一致。研究結果表明，利用SSR標記鑒定辣椒雜交種純度是切實可行的。利用12對多態性明顯、穩定可靠的SSR引物對部分辣椒自交系進行遺傳多樣性分析，共擴增出60條條帶，多態性位點比率為100%，平均每對引物檢測出5個等位基因。30份辣椒自交系間遺傳相似系數變幅為0.33～1.00，平均為0.65，表明供試材料間具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析結果表明，在遺傳相似系數為0.47時，可以將中國辣椒和一年生辣椒區分開來。在遺傳相似系數為0.85時，30份辣椒優良自交系分為11個類群，辣椒種質遺傳關系與地理來源和農藝性狀具有一定的相關性。

關鍵詞 熱辣2號；SSR；雜交種；純度鑒定；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號 S641.3 文獻標識碼 A

種子是重要的農業生產資料，開展雜交種純度檢測對保證種子質量、提高生產效益與雜種優勢的有效利用具有重要意義[1]。作物雜交種純度檢驗的常用方法主要包括田間種植鑒定和同工酶電泳鑒定等[2]。田間種植鑒定主要基于成株期植株及果實的形態特征，需要耗費大量的土地資源和勞動力，試驗周期較長，并且易受環境條件的影響[3-4]。對于遺傳基礎比較狹窄的作物，真正的雜交種和假雜交種形態差異不一定總是很明顯，鑒定結果的準確性會受到影響。同工酶電泳鑒定具有組織器官特異性，受植株發育階段的影響，多態性水平較低[5-6]。傳統的鑒定方法難以滿足作物品種純度鑒定在精確度方面的要求。急需開發一種簡單、快速、準確的雜交種純度檢測方法。分子標記技術可以彌補雜交種純度傳統鑒定中的許多缺陷，為作物雜交種純度鑒定提供一種準確、快速和簡便的方法。Ballester等[7]和李成偉等[8]利用RAPD分子標記技術鑒定辣椒雜交種純度，結果證明RAPD技術可用于辣椒雜交種純度的快速鑒定。王得元等[9]和李智軍等[10]利用RAPD分子標記技術分別檢測‘粵椒1號和黃皮尖椒‘秀黃F1種子純度，鑒定結果與田間檢測結果完全一致。

種質資源是栽培品種改良、新品種選育的基礎。辣椒作為一種世界性蔬菜作物具有豐富的遺傳和表型多樣性，遺傳多樣性分析是種質資源評價和利用的主要內容之一。加強辣椒遺傳多樣性研究，篩選優異種質資源，對改良辣椒品種、提高辣椒產量和品質具有重要意義。陳學軍等[11]利用RAPD、ISSR標記及表型數據對13份辣椒材料進行遺傳多樣性分析，結果表明基于RAPD、ISSR的聚類結果與基于表型數據的聚類結果之間存在極顯著正相關，能夠將一年生辣椒與其它栽培種區分開來。李晴等[12]利用RAPD標記分析了37份辣椒種質遺傳多樣性，將37份辣椒種質分為5個類群。

盡管RAPD標記操作簡單，檢測快速，不需要提前知道基因組序列信息，但RAPD標記多為顯性標記，檢測結果重復性和穩定性較差，易受各種因素影響，ISSR分子標記大部分為顯性標記，利用RAPD和ISSR標記進行種子純度鑒定和遺傳多樣性分析具有一定的局限性。SSR，即簡單序列重復，是一類由幾個核苷酸為重復單位組成的串聯重復序列。SSR標記在真核生物基因組中具有數量豐富、分布均勻、共顯性遺傳、等位性變異豐富、操作簡單、不受環境因素影響、穩定性和重復性好等優點，是進行作物遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構建、雜交種純度鑒定、基因定位及標記輔助育種的理想標記類型[13]，已在多種農作物雜交種純度鑒定中得到應用[14-15]。但在辣椒雜交種純度鑒定及遺傳多樣性分析方面鮮有報道。本研究擬利用SSR標記技術對熱辣2號黃燈籠椒雜交種進行純度鑒定并對海南地區30份辣椒優良自交系進行遺傳多樣性分析，以期為辣椒良種的及時銷售與種質資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒雜交種一代熱辣2號醬用型黃燈籠辣椒，母本材料CAYB02和父本材料CAYB01由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所提供。熱辣2號醬用型黃燈籠辣椒是中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所經多年研究選育出的雜種一代醬用型黃燈籠椒。播種至開花約需80 d，至大量收獲約需142 d，生長勢強，始收時株高55～60 cm，最高株高130 cm，最大開展度90 cm，分枝能力極強，葉淺綠色至綠色，每節花數為3～10朵，未成熟果深綠色，老熟果中黃色至深黃色，果長5.5 cm左右，果寬3.5 cm左右，單果重14.5 g左右，最大單果重可達22 g，每果位座果1～3個，個別果位可座果4～6個，一般單株座果130個左右，每公頃產量45 000 kg左右，最高可達75 000 kg。

供試辣椒優良自交系共30份，均是經過多次雜交、回交和自交選育出的自交系，抗逆性及部分農藝性狀表現優良，并且適應海南地區的氣候條件。其中中國辣椒22份，一年生辣椒8份。在22份中國辣椒種質中，7份來自中國，6份來自英國，7份來自法國，1份來自美國，1份來自巴西。在8份一年生辣椒種質中，7份來自中國，1份來自美國。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 將供試的辣椒材料播種于營養缽中，按照常規栽培措施進行管理，待植株生長至4～5片真葉時取材提取葉片基因組DNA，提取方法采用Liu等[16]的CTAB法提取。

1.2.2 多態性標記分析 選取來源地和農藝性狀差異顯著的中國辣椒材料CAYB01、CAYB02和一年生辣椒CA269的基因組DNA為模板，利用已開發的辣椒SSR引物（http：//solgenomics.net/search/markers）進行擴增，篩選多態性的SSR標記。

PCR反應體系為10 μL，其中包括10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），45 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，

0.2 mmol/L dNTPs，55 ng引物，0.5 U Taq DNA聚合酶，60～80 ng模板DNA。擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，50～60 ℃（根據具體引物的退火溫度而定）退火35 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃終延伸8 min。PCR產物保存于4 ℃。5 μL擴增產物與2 μL上樣緩沖液混合經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺 ∶ 甲叉雙丙烯酰胺=39 ∶ 1）電泳，銀染顯色進行帶型統計。

1.2.3 熱辣2號種子純度鑒定 以熱辣2號黃燈籠椒單株DNA為模板，利用在親本材料間表現為共顯性的SSR標記進行擴增，根據特異譜帶的有無檢測雜交種的純度。將取材后的辣椒幼苗按照順序移栽到土質肥沃的地塊，采用常規措施進行管理，在熱辣2號黃燈籠椒成株期依據品種特征特性逐株進行鑒定，將標記鑒定結果與田間鑒定結果進行比較分析。

1.3 數據統計與分析

將電泳圖譜上清晰條帶記為“1”，同一位置沒有條帶記為“0”，構建[1， 0]二元數列矩陣，利用NTsys_2.10e軟件Qualitative data相似性分析模塊計算供試材料間的遺傳相似系數，采用SAHN聚類分析模塊中的UPGMA法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 熱辣2號親本間多態性標記篩選

以熱辣2號母本材料CAYB02和父本材料CAYB01為模板篩選85對辣椒SSR引物，其中12對引物在親本間能擴增出明顯的多態性，多態性比率為14.12%，多態性標記分別位于辣椒1、3、4、6、7、9、11、12號染色體，多態性片段大小100～300 bp。

2.2 熱辣2號雜交種純度鑒定

利用多態性的共顯性標記SSR7、SSR58和SSR64對165株熱辣2號黃燈籠椒進行純度鑒定，從SSR標記擴增結果看出，163個熱辣2號單株既具有母本特異譜帶也具有父本特異譜帶，屬于真實的雜交種，5號和24號單株缺少父本特異帶，與母本擴增帶型一致，說明5號和24號單株為母本自交株，3對標記的鑒定結果完全一致（圖1），熱辣2號雜交種的純度為98.79%。成株期田間調查結果發現，5號和24號植株與母本性狀一樣，果皮顏色為淺綠色，其余植株均具有熱辣2號黃燈籠椒典型特征，果皮顏色為深綠色。田間形態學鑒定結果與SSR標記檢測結果完全一致，試驗結果說明SSR技術可用于醬用型辣椒熱辣2號的種子純度快速檢測。

2.3 遺傳相似性分析

以中國辣椒材料CAYB01、CAYB02和一年生辣椒CA269的基因組DNA為模板篩選85對辣椒SSR引物，其中22對引物在三份材料間存在多態性，多態性比率為25.88%。選取12對擴增條帶清晰，穩定性和重復性較好的SSR標記，分別位于1、2、3、5、7、9、11、12號染色體上，對30份辣椒優良自交系進行多樣性分析。12對SSR標記在辣椒優良自交系中共擴增出60條條帶，多態性比率為100%，多態性片段大小為100～360 bp（表3和圖2）。統計PCR擴增條帶，按照條帶的有無分別記為1和0，構建數據矩陣，利用NTsys_2.10e軟件計算遺傳相似系數，在供試的30份材料中，不同辣椒種質間遺傳相似性系數變幅為0.33～1.00，平均為0.65，表明這些自交系間遺傳差異較大。其中一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8間，中國辣椒CA05和CA16間，中國辣椒CA15和CA09間相似性系數最大，為1.00，表明這些材料間親緣關系較近。中國辣椒CA12與一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8間相似性系數最小，為0.33，表明中國辣椒CA12與一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8親緣關系較遠。

2.4 聚類分析

基于辣椒種質間相似系數矩陣，利用NTsys_2.10e軟件進行聚類分析，在遺傳相似系數為0.47處可以將中國辣椒種質資源與一年生辣椒種質資源區分開。在遺傳相似系數為0.85處，30份辣椒優良自交系資源被分為11個類群，第1類群包括11份中國辣椒種質，分別為來自中國海南2份，來自法國7份，來自巴西1份，來自中國云南1份。第2類群包括5份來自英國的中國辣椒種質。第3類群包括1份來自英國的中國辣椒種質。第4類群包括1份來自美國的中國辣椒種質。第5、6、7、8類群分別包含1份來自中國的中國辣椒種質。第9類群包括5份來自中國的一年生辣椒種質，其中CA202、CAF9、CAF1和CAM8屬于一年生辣椒中的燈籠椒，CA267屬于一年生辣椒中的短錐椒。第10類群包括2份來自中國的一年生辣椒種質CA211和CA92，屬于一年生辣椒中的長角椒。第11類群包括1份來自美國的一年生辣椒種質CA269，屬于一年生辣椒中的櫻桃椒。同一來源地的材料和農藝性狀相似的材料具有聚集在一起的趨勢，如來自中國海南的CAYB01和CA07，來自法國的CA05和CA16，CA04和CA17，CA15和CA09，來自英國的CAYB02、CA60、CA57、CA78和CA49，一年生燈籠椒CA202、CAF9、CAF1和CAM8，一年生長角椒CA211和CA92。第3、4、5、6、7、8和11類群分別由1份種質材料組成，表明這7份種質與其余種質親緣關系較遠（圖3）。本研究室選取親緣關系較遠的中國辣椒自交系配制了雜交組合，其中CAYB02×CAYB01、CA12×CA11、CAYB02×CA11、CA12×CA18的辣度分別為172 000、214 000、217 000和332 000 SHU，產量和綜合抗病能力均優于本地對照品種。

3 討論與結論

辣椒在制種過程中大部分都是通過人工去雄完成的，所以影響辣椒雜交種子純度的主要問題就是母本去雄不徹底形成的自交種。此外，制種過程中的串粉及收獲后的機械混雜也是導致雜株產生的原因。分子標記技術因其準確、快速、穩定、不受環境因素影響、無器官、組織及發育特異性等特點，已逐步成為作物雜交種純度檢測的主要工具[17]，近年來，RFLP、AFLP、RAPD和ISSR標記被廣泛用于作物品種指紋圖譜構建、種子純度鑒定和種質資源鑒定[18-20]。但RFLP標記價格昂貴、操作流程比較復雜并且帶有放射性；AFLP標記對DNA的質量要求很高，不適于進行大批量雜交種純度鑒定；RAPD和ISSR標記多為顯性標記，不能將雜合體和純合體有效區分。SSR標記數量豐富，在植物基因組上均衡分布[21-22]，共顯性遺傳，穩定性和重復性較好，目前是進行作物雜交種純度鑒定最理想的標記類型，被廣泛用于作物種子純度鑒定[23-25]。但在辣椒雜交種純度鑒定方面鮮有報道。本研究利用SSR標記檢測熱辣2號黃燈籠椒雜交種純度，分子標記鑒定結果與田間鑒定結果完全一致，熱辣2號雜交種純度為98.79%，熱辣2號黃燈籠椒雜交種中僅混雜了母本自交種，可能是由于去雄不徹底導致的母本自交種。該研究結果表明利用SSR分子標記技術檢測熱辣2號雜交種純度是切實可行的。

Nandakumar等[26]和Yashitola等[17]研究提出單對多態性的SSR標記可以充分地對雜交種純度進行鑒定。然而，在品種選育過程中因親本自交代數不夠，存在親本本身遺傳背景未完全純合的現象，某些位點還處于雜合狀態，因此利用這些標記位點進行純度檢測的結果準確性較差。Sundaram等[27]利用多對SSR標記基于多重PCR技術對水稻雜交種進行純度檢測，進一步證明了多對標記檢測相對于單對標記檢測在準確性方面的優勢?；谶@一觀點，為確保鑒定結果的準確性和可靠性，本研究選取3對位于辣椒不同染色體上的共顯性SSR標記檢測熱辣2號黃燈籠椒雜交種純度，3對標記的檢測結果完全一致，并且分子標記檢測結果與田間形態鑒定結果達到了完全一致，這也進一步表明熱辣2號黃燈籠椒親本材料純合度較高。

作物種質資源是實現各個育種途徑的原始材料，育種效果在很大程度上決定于原始材料的選擇。對種質資源遺傳多樣性進行研究有助于了解不同種質的遺傳背景及品種間的親緣關系，可以有效地進行親本選配，從而更加合理地進行試驗設計[28]。本研究利用位于辣椒不同染色體上SSR標記對30份辣椒優良自交系進行遺傳多樣性分析，遺傳相似性分析結果表明供試辣椒種質間具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析結果表明，SSR標記可以把不同栽培種的辣椒材料區分開來，相同來源地的材料和農藝性狀相似的材料具有聚集在一起的趨勢，如來自中國海南的CAYB01和CA07，來自法國的CA05和CA16，CA04和CA17，CA15和CA09，來自英國的CAYB02、CA60、CA57、CA78和CA49，一年生燈籠椒CA202、CAF9、CAF1和CAM8，一年生長角椒CA211和CA92。CASM4、CA44、CA01和CA38雖都為來自中國的中國辣椒種質，但卻單獨聚為一類，這可能是由于種質資源的遺傳改良導致了遺傳背景的差異。第3、4、5、6、7、8和11類群分別由1份種質材料組成，表明這7份種質與其余種質親緣關系較遠。實踐中為了更好地利用雜種優勢，可以選取親緣關系較遠的種質配制雜交組合。本研究室已經根據中國辣椒自交系的親緣關系配制了雜交組合，其辣椒素的含量均顯著優于對照品種。

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