多重PCR技術在橡膠樹轉基因分子鑒定中的應用

李季 黃天帶 華玉偉等

摘 要 為了同時檢測橡膠樹轉基因胚狀體和葉片中含有的多個目標基因序列，并排除擴增結果的假陰性，利用正交試驗首次建立了橡膠樹管家基因（HbActin）、目標基因新霉素磷酸轉移酶II（NptII）基因和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因的多重PCR檢測體系。利用2種酶（PCR Mix酶和Taq酶）對18個轉基因胚狀體和葉片進行單一引物PCR擴增和多重PCR檢測。結果表明：多重PCR檢測結果與單一PCR結果完全一致，且多重PCR體系帶型清晰，無非特異性擴增，更易讀取。多重PCR檢測系統具有簡單、準確并且高效等特點，只需要進行一個反應就可以檢測多個目標基因序列，因而在轉基因分子鑒定上具有非常重要的應用價值與潛力。

關鍵詞 多重PCR；橡膠樹；轉基因胚狀體；轉基因葉片；分子鑒定

中圖分類號 Q781 文獻標識碼 A

聚合酶鏈式反應（PCR）是轉基因分子檢測中最普遍的方法之一，其檢測多為單一靶位點的擴增，對多目標基因而言，需要進行多次的PCR反應，不僅耗時耗力，成本也較高。多重PCR技術最初由Chamberlain等[1]提出，是指在一個反應體系中進行多個靶位點擴增的PCR技術。因其具操作簡單、特異性強、靈敏度高、實驗成本低、可加速實驗進程等優點，該技術被廣泛應用于人類及家禽疾病的診斷[1-4]、植物純度及品種鑒定[5-8]、轉基因成分與定量檢測[9-19]等。不過，多重PCR要求多個不同的引物能在同一反應體系中進行特異性擴增，因此需要對影響其擴增效果的因素進行優化，主要優化因素有循環參數、反應體積、反應體系、引物間的堿基配對等[20]。

本研究以轉基因橡膠樹胚狀體和葉片為材料，對多重PCR反應體系中的退火溫度、引物濃度比例及PCR反應體系的組分進行正交實驗優化，首次建立了橡膠樹管家基因引物HbActin-P1/P2與載體特異基因引物Npt-f/r和Gus-f/r的PCR Mix酶以及Taq酶的多重PCR檢測體系，并與單一引物擴增的結果對比，驗證了優化后的多重PCR反應體系的準確性及靈敏性，為后續外源基因的快速檢測工作提供了便利。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 轉基因材料與質粒材料 攜帶有外源NptII基因和GUS報告基因的橡膠樹轉基因胚狀體及轉基因穩定期葉片由本實驗室提供。表達載體pCAMBIA2301質粒由本實驗室留存。

1.1.2 試劑 Taq酶，dNTPs，RNaseA等購自Fermentas公司，PCR Mix酶[2×Eco Taq PCR SuperMix（+dye）]購自北京全式金生物技術有限公司，DL 2 000 Marker購自大連Takara公司，NptII、GUS基因以及橡膠樹管家基因HbActin的引物由深圳華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 單一引物PCR擴增 來源于NptII和GUS基因的引物Npt-f/r和Gus-f/r序列及擴增產物大小見李季等[21]報道，橡膠樹管家基因HbActin的引物HbActin-P1/P2序列HbActin-P1：CACCACTCAGCA

CAATGTTACC；HbActin-P2：GATTCCGTTGCCCAG

AAGTC，片段大小為154 bp。PCR擴增采用15 μL 反應體系，PCR Mix酶擴增體系為2×PCR Mix 7.5 μL，上下引物各0.3μL。Taq酶擴增體系：10×Taq Buffer 1.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.15 μL，10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，2 μL上述DNA溶液，用滅菌水補足至15 μL。模板參照李季等[21-22]報道的方法，提取18個轉基因胚狀體和轉基因植株葉片DNA。HbActin-P1/P2引物最佳復性溫度為60 ℃，復性40 s，72 ℃延伸時間為30 s，其余2對引物的最佳復性溫度、延伸時間及PCR反應過程中的所用對照組與李季等[22]報道相同。HbActin-P1/P2引物的PCR擴增產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余引物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.2 多重PCR最佳退火溫度的確定 PCR Mix酶和Taq酶的多重PCR檢測體系同單一引物PCR擴增反應體系，3對正反向引物各加0.3 μL，模板為轉基因陽性植株Tj200863-2的葉片DNA[22]。根據引物的Tm值，選擇中間溫度為58 ℃，上下波動3 ℃，PCR反應在eppendorf Mastercycler gradient PCR儀器中進行，PCR儀自動生成12個梯度退火溫度，分別是55.0、55.1、55.4、56.0、56.7、57.4、58.3、59.1、59.9、60.5、61.0、61.3 ℃。

1.2.3 多重PCR最佳引物濃度的確定 根據1.2.2確定的最佳退火溫度，2種酶15 μL的反應體系中，其余成分濃度保持不變，采用L4（23）正交設計試驗，確定PCR反應體系中3對引物濃度比例。

1.2.4 多重PCR最佳組分濃度的確定 根據1.2.2和1.2.3中確定的最佳退火溫度以及3對引物最適宜的濃度，對Taq酶PCR體系中各組分（Mg2+，dNTPs和Taq酶）濃度進行優化篩選，同樣設計L4（23）正交試驗。

1.2.5 多重PCR體系的驗證 分別選取18株橡膠樹轉基因胚狀體和轉基因葉片DNA為材料，利用上述優化后的條件進行PCR Mix酶和Taq酶的多重PCR檢測，檢測方法同單一PCR，多重PCR擴增產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 不同退火溫度對多重PCR的影響

2.2 不同引物濃度對多重PCR的影響

2.3 不同PCR組分對多重PCR的影響

2.4 單一PCR擴增與多重PCR擴增結果比較

2.4.2 單一PCR與多重PCR（Taq酶）的擴增結果比較 根據上述優化的Taq酶的多重PCR擴增體系，結合單一PCR擴增對隨機挑選的18個轉基因胚狀體和轉基因植株葉片DNA進行檢測，結果如圖5所示。Taq酶的多重PCR擴增結果帶型清晰，3對引物所擴增條帶亮度一致并與單一PCR的擴增結果相同，且無非特異性擴增條帶，結果比單引物PCR擴增更易讀取且準確。

3 討論與結論

多重PCR可以同時檢測多個目的基因的片段，操作簡單，速度快，費用低，同時也大大降低了產物污染的可能性[23-24]。但成功的多重PCR試驗與周密的試驗設計是分不開的，因為在一個反應體系中，不同目的片段的擴增是相互競爭的，引物組合、引物濃度、退火溫度等都會影響多重PCR的結果[25]，而反應體積、不同延伸溫度、循環次數對其擴增效果影響較小[20]。因此在建立多重PCR體系時，針對影響較大的因素進行優化十分必要[23，26]。本研究認為利用PCR或多重PCR方法檢測轉基因植株外源基因的存在時，要確保已提取到的DNA質量及DNA提取物中不含抑制PCR反應的物質，因此有必要進行內源基因的PCR擴增[13]。但單獨進行DNA質量的檢測或者PCR擴增費時費力，因此，本研究創建的多重PCR體系中引入了橡膠樹管家基因HbActin，以評估模板DNA質量以及PCR擴增反應的效果，同時以宿主內部的特異基因作為對照，有效避免了由于DNA提取質量或試驗操作失誤所造成的假陰性問題，提高檢測效率[27]。轉基因外源基因成分檢測時，NptII基因和GUS基因是常見的檢測項目。在多重PCR體系中，引物設計至關重要，一般要注意引物長度不宜過長；引物之間應減少同源性；引物間最好有相近的退火溫度；通過調整引物濃度確保不同目標基因的擴增效率一致等[26]。此前，筆者針對這2個基因均設計了相應引物，單一引物擴增時兩者擴增效果較好，擴增片段大小差異較大，分別是453 bp和1 203 bp，而橡膠樹管家基因HbActin基因片段大小僅為154 bp，三者通過瓊脂糖凝膠電泳很容易區分，為此，本研究將這3對引物同時放在多重PCR體系中，PCR擴增結果顯示三者存在競爭，擴增條帶清晰，可有效避免檢測過程中假陽性的出現，進而提高檢測效率。根據郝玉芹等[28]和李政利等[29]的正交試驗針對引物退火溫度、引物濃度比例及PCR組分等進行優化，由實驗結果可以看出，引物濃度比例在2種酶體系中不同，而PCR組分在Taq酶體系中與單一PCR相同。王鳳格等[30]在建立玉米高通量多重PCR擴增體系時，選擇與穩定有效的單一PCR反應相同的條件，并遵循引物組合的一般原則，直接應用到多重PCR體系中，無需進行繁瑣的優化，同樣可以得到正常的擴增結果。Ma等[31]和劉正斌等[23]也提出這樣的方法能取得令人滿意的結果。但本研究中2個酶的多重PCR體系中最佳退火溫度均與單一引物PCR體系不同，且Taq酶體系中的引物濃度比例與單一PCR有所差別。因此，從本研究的結果可以得知，即便比較成熟的多重PCR反應體系，也要根據不同的模板、酶以及引物對實驗條件加以調整優化，以保證結果的特異性和可靠性，這與吳 影等[15]、胡毅玲等[32]、邵碧英等[11，33]報道的結果一致。而對于其他目的基因的檢測，由于在多重PCR體系中各引物的交叉結合使得非特異性擴增產生的可能性十分小，因此，理論上只要不同引物之間互補的堿基不多，片段大小不太接近，退火溫度相近，單一PCR檢測時穩定性好，引物對的數量可以不限[6， 23， 26]。

在進行大規模的轉基因檢測過程中，PCR Mix酶的擴增優越性要高于Taq酶，而且操作更為簡便，但在擴增過程中存在的非特異性擴增可能會造成假陽性現象的出現，故在前期大規模檢測時可以采取PCR Mix酶擴增，挑選出可能的陽性胚狀體或者單株，而后利用保真度更高的Taq酶加以驗證。因此，本研究針對早期的胚狀體和轉基因植株葉片均進行了2種酶的多重PCR體系的優化，并取得較好的效果，同單一引物PCR擴增結果比較，其檢測效率明顯提高，結果也更可靠。

綜上所述，本研究通過比較多重PCR擴增與單一引物PCR擴增可知，兩者結果完全一致，且多重PCR結果更為清晰，無非特異性擴增，結果更準確。因此將多重PCR方法應用于轉基因橡膠樹外源基因的檢測是完全可行的。

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責任編輯：林海妹