李親緣關系SRAP分析

劉雨 廖明安 邱麗娜等

摘 要 利用相關序列擴增多態性（SRAP）標記對巴山脆李及達州地區優良脆李資源進行親緣關系分析，為巴山脆李品種的鑒定和其他李資源的保護及利用提供理論依據。從180對引物組合中篩選出12對多態性高、擴增譜帶清晰的SRAP引物，對22份李資源進行擴增，共獲得103條譜帶，其中多態性譜帶64條，多態性比率為60.34%。平均每對引物組合擴增出多態性譜帶5.42條。利用UPGMA法構建樹狀聚類圖，在相似性系數0.68處可將22份樣品分成3組。聚類結果與按果形分類結果一致，與其地理位置和熟期也存在一定的相關性。

關鍵詞 李；親緣關系；SRAP分析

中圖分類號 S662.3 文獻標識碼 A

李是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物。為開發、保護和利用李資源，1992年達州地區對李樹進行調查，通過果實品質的評價初步篩選出65個比較優良的變異單系，再對65個變異單系的物候期、生長結果習性等進行調查測試，進一步篩選出22個優異變異單系。從22個變異單系中審定了‘巴山脆李品種?！蜕酱嗬頪1]是達州地區‘青脆李變異單系，來源于1株60余年的青脆李樹，在果形、平均單果質量、成熟期上發生變異。為進一步選育新品種，了解當地資源的遺傳基礎與差異，需對親緣關系進行分析研究。

國內外學者曾從農藝性狀[2]、孢粉學[3]、RAPD分子標記[4]、SSR分子標記[5]、ISSR分子標記[6]等不同側面對李遺傳變異進行分析，研究中國李種質資源親緣關系，但存在一定的分歧。Li和Quiros[7]根據基因中外顯子富含CG，而內含子和啟動子富含AT的特點開發出獨特的雙引物設計對基因的ORFs（Open reading frames）的特定區域進行擴增的SRAP分子標記。目前SRAP分子標記在屬內種間[8]，種內品種間[9]親緣關系鑒定中運用廣泛，并且在親緣關系很近的種內鑒定中表現優良[10]，但SRAP在中國李中的應用未見報道。筆者利用SRAP分子標記對22份李資源進行分析，旨在為巴山脆李品種的分子鑒定和其它李資源的保護和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

參照謝志亮等[13]的方法從新鮮幼嫩葉片中提取李基因組DNA。DNA用Bio-Photometer核酸檢測儀檢測濃度，將純化的DNA稀釋到100 ng/μL備用。

反應體系以Li與Qurio[7]提出的體系以及前人[12]在桃中建立優化SRAP-PCR體系為參照，在25 μL體系中，Taq DNA聚合酶0.4 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，模板DNA 45 ng，dNTPs 200 μmol/L，引物0.75 μmol/L。擴增程序是94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復性 1 min，72 ℃延伸90 s，5個循環；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸8 min，4 ℃保持擴增結束后，取6 μL擴增產物，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液1×TBE（0.09 mmol/L Tris，0.002 mmol/L乙酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0），電壓90 V電泳2 h，以100 bp DNA Ladder作為分子量標記，EB染色后在SYNGENE凝膠成像系統上觀察并拍照記錄。

1.3 數據處理與分析

利用Gel-Pro analyzer軟件獲取原始數據，電泳圖譜上有條帶記為“1”，同一位置沒有出現的帶記為“0”，從而生成由“1”和“0”組成的原始矩陣。計算多態性信息含量（Polymorphism information content）PIC=1-ΣPi2[14]。用NTSYS-pc 2.10（numerical taxonomy and multivariate analysissystem，NTSYS）[15]軟件進行SM相似系數計算和基于UPGMA算法的聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SRAP擴增產物多態性及親緣關系分析

2.2 基于SRAP標記的聚類分析

從在相似系數SM=0.72處可將材料分為8組。巴山脆李、通川6號、通川7號各單獨分為一組，從分子水平上證實了巴山脆李品種與其他資源材料間存在遺傳差異。來自通川的資源除通川4號與通川8號全部分為一組，萬源的資源除萬源4號全部分為一組，表現出與果實成熟期相似的趨勢。其中巴山脆李和達縣1號相似系數為0.477 2，親緣關系最遠。從選配親本的角度考慮，這兩種資源遺傳基礎較寬，親緣關系較遠，進行雜交來進行遺傳改良的潛力大。通川8號和萬源1號相似系數為0.840 9，親緣關系最近，生活在不同縣區，可能來源于同一親本。

大竹雞心李作為22分材料中唯一果肉為紅色的材料，在聚類分析中并沒有單獨成為一類，而是與來源地相同的其他材料聚為一類。表明李種質資源的分類與果肉顏色無明顯的相關性。

3 討論與結論

3.1 SRAP在李資源分析中應用的可行性

國內外學者研究表明，SRAP在形態學變異和形態學發展史上比AFLP更具有一致性[9]；比RAPD表現更穩定[16]，更有利于遺傳育種評價；擴增的條帶數和多態性位點數[17]更豐富；能夠更好地區分近源種[18]。SRAP是評價遺傳多樣性、品種鑒定有效的手段。本研究表明，SRAP分子標記用不同引物擴增出的條帶清晰，條帶多形態性信息含量豐富，進行UPGMA法聚類分析，同一果形的變異單系聚為一類，分類結果與果形相符，具有近似熟期的變異單系以及在同一地理位置的變異單系基本聚在一起，分類結果與熟期、資源地理分布基本相符，說明SRAP用于探討巴山脆李及達州地區優良脆李資源間的親緣關系是可行的，能夠在探討中國李親緣關系中進行應用。

3.2 李種質間的親緣關系

巴山脆李是青脆李的實生變異通過審定的品種[1]。經過多年觀察比較，該品種比親本青脆李成熟期延后約30 d；果實為圓形，果頂微凹，而青脆李果形為扁圓形，果頂平；果實較大，平均單果重約40 g，而親本‘青脆李的平均單果質量只有30 g左右；在達州海拔700 m的地方栽植，果實于8月中旬成熟，在自然條件下，果實貨架期可達10 d左右。本實驗分子標記結果顯示，來自同一縣區的種質資源聚在一起，表明巴山脆李與通川區其他種質有著較近的親緣關系，但在相似系數SM=0.72處巴山脆李從通川區種質中分離出來，獨立成為一組，表明巴山脆李的基因水平雖然與通川區其他種質相似，但也存在部分差異。對巴山脆李遺傳背景的研究，筆者認為可結合SRAP分子標記技術和其他分子標記對通川區其他種質資源和巴山脆李做進一步分析。同一縣區的種質資源親緣關系較近，推測是來源比較近或長期實生繁殖的原因，顯示出較近的遺傳距離，應適當引入國內外優質李品種，擴大當地李資源的遺傳多樣性，降低生態系統性風險。

3.3 本實驗存在的不足

聚類結果顯示通川8號與萬源1號有著很近的親緣關系。但通川8號來源于達州市通川區海拔300 m左右的低海拔地區，于8月中下旬成熟，屬于中熟或中晚熟種質資源，萬源1號來源于萬源市海拔1 000 m左右的地區，是9月中下旬成熟的晚熟種質。通川8號的平均單果質量明顯大于萬源1號。兩者局部外部形態學差異可能來源于外界生存環境條件差異，或者是變異差異點檢測不完全，這還需要進一步探討。

參考文獻

[1] 廖明安， 劉學琦， 王志德， 等. 李新品種‘巴山脆李[J]. 園藝學報， 2012， 39（11）： 111-112.

[2] 姜英淑. 歐李抗逆性研究和不同資源農藝性狀與分子標記遺傳變異[D]. 哈爾濱： 東北林業大學， 2009.

[3] 耿文娟， 楊 磊， 刁永強， 等. 野生歐洲李花粉特性研究初探[J]. 吉林農業大學學報， 2011（4）： 385-389.

[4] 喬玉山， 章 鎮， 房經貴， 等.中國李RAPD的優化反應體系及其在品種鑒定中的應用[J]. 果樹學報， 2003， 20（6）： 445-449.

[5] 薛華柏， 喬玉山， 章 鎮， 等. 區分2個中國李品種的微衛星標記的開發[C]. 第二屆全國果樹分子生物學學術討論會論文集， 2009.

[6] Weisheng Liu， Dongcheng Liu， Aimin Zhang， et al. Genetic Diversity and Phylogenetic Relationships among plum germplasm resources in China assessed with inter-simple sequence repeat markers[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2007， 132（5）： 619-628.

[7] Li G， Quiros C R. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP）a neap marker system based on a simple PCR reaction： Its applicationto mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001， 103： 455-461.

[8] 高麗霞， 胡 秀， 劉 念， 等. 中國姜花屬基于 SRAP 分子標記的聚類分析[J]. 植物分類學報， 2008， 46（6）： 899-905.

[9] Ferriol M， Pico B， Nuea F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucubita pepo using SRAP and AFLP markers[J]. Theor Appl Genet， 2003， 107： 271-282.

[10] Juan J Ruiz， Santiago Garcia-Martinez， Belen Pico， et al.Genetic variability and relationship of closely related Spanish traditional cultivars of tomato as detected by SRAP and SSR makers[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2005， 130（1）： 88-94.

[11] 王善廣， 張華云， 榮俊杰， 等. 中國李標準葉片的取樣部位[J]. 園藝學進展， 1994， 495-495.

[12] 史紅麗， 韓明玉， 趙彩平. 桃SRAP-PCR體系的建立與優化[J]. 華北農學報， 2008， 23（增刊）： 201-204.

[13] 謝志亮， 何業華， 彭 兵， 等.幾種三華李基因組DNA提取方法的比較研究[J]. 中國南方果樹， 2010， 39（1）： 56-59， 64.

[14] Anderson J A， Churchill G A， Autrique J E， et al. Optimizing parental selection for genetic linkage maps[J]. Genome， 1993， 36： 181-186.

[15] Rohlf F J. NTSYS-pc： Numerical taxonomy and multivariate analysis system， Version 2.10[M]. Exeter Software， New York， 2000.

[16] 李翠翠， 郭立忠， 盧偉東， 等. RAPD和SRAP分子標記在真姬菇菌種鑒定中的應用[J]. 食用菌學報， 2009， 16（1）： 21-25.

[17] 徐美蘭， 金正勛， 李曉光， 等. 7個粳稻SSR和SRAP分子標記遺傳距離比較及其與產量性狀雜種優勢的關系[J]. 分子植物育種， 2009， 7（6）： 1 084-1 092.

[18] Riaz Ahmad， Dan Potter， Stephen M S. Genotyping of Peach and Nectarine cultivars with SSR and SRAP Molecular makers[J]. Journal of the American Society for Horticulture Science， 2004， 129（2）： 204-210.