超聲處理對堿法制備蠶蛹蛋白條件的優化

穆利霞 廖森泰 詹寶瑟等

摘 要 通過單因素分析及響應面優化，研究超聲處理對堿法制備蠶蛹蛋白得率的影響，得到了蠶蛹蛋白得率的數學模型，優化了制備條件，提高了堿法制備蠶蛹蛋白的得率。結果表明：NaOH濃度和液固比（V/m）對蠶蛹蛋白得率影響顯著（p<0.05）。蠶蛹蛋白浸提的最佳工藝條件為：超聲功率400 W，超聲時間20 min，浸提液固比（V/m）60 ∶ 1，NaOH濃度0.3%。在此工藝條件下，蠶蛹蛋白的得率為88.14%。制備的蠶蛹蛋白中的必需氨基酸含量符合FAO/WHO推薦標準，可以作為食品基料使用。

關鍵詞 超聲處理；蠶蛹蛋白質；蛋白得率；優化

中圖分類號 S377 文獻標識碼 A

蠶絲業起源于中國，具有5 000多年的歷史。我國的蠶絲業長期以來在國際上占據壟斷地位，目前蠶繭和生絲產量占全球總產量的70%以上[1]。作為繅絲行業的副產物，蠶蛹因為含有的豐富營養活性成分使其被衛生部列為“食品新資源”中唯一的昆蟲類食品[2]。蠶蛹干物質中蛋白含量可達到48.7%～52.5%[3]，蠶蛹蛋白中的必需氨基酸含量占總氨基酸含量的42%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為0.7[4]，完全符合WHO/FAO提出的蛋白參考模式。

常用的蛋白制備方法主要有：堿法、酶法、Tris-HCl法、鹽法以及有機溶劑法，其中堿法和酶法在工業中應用較多。相比于酶法，堿法制備的效率高、能耗和成本較低，更適合于工業化生產。蠶蛹蛋白的制備多采用堿法和有機溶劑法制備，有機溶劑法制備蠶蛹蛋白容易造成溶劑的殘留，陳芳艷等[5]則采用醇溶法制備蠶蛹蛋白，蛋白得率僅為8.47%，不能廣泛應用。蠶蛹蛋白難溶于水，目前堿法制備蠶蛹蛋白的報道中，多采用高溫長時間浸提或極大的液料比來獲得較高的浸提率[6-8]。孫雁等[6]認為：高溫長時間的浸提會使生成的蠶蛹蛋白蛹臭味濃，顏色較深，需要進一步采用有機溶劑或者臭氧脫色脫臭，而且造成蛋白的過度降解，對其加工特性（如起泡性，溶解性等）造成不同程度的影響；較大的料液比在一定程度上增加了生產造成的占地規模、能耗、廢水處理等成本，不利于產品的工業化生產。因此，改進蠶蛹蛋白制備工藝的意義重大。

近年來，超聲波作為一種物理的手段和工具，為科研工作者提供了一條能夠把能量引入到分子中的高效途徑和方法。超聲波是頻率大于20 kHz的聲波，具有波動與能量的雙重屬性，能改變蛋白質分子結構，破壞蛋白質分子內鍵，對蛋白質溶解性有一定影響[9-10]。因此，超聲的應用有助于提取過程中蛋白的溶出，從而提高蛋白的得率。超聲協助堿法制備蛋白的方法已經在花生分離蛋白、芡實蛋白、松仁蛋白等方面展開，并取得顯著的成效[11-13]。

本研究以繅絲蠶蛹為原料，通過單因素分析及響應面優化，研究了超聲處理對堿法制備蠶蛹蛋白的影響，建立超聲協助堿法制備蠶蛹蛋白的數學模型，并優化制備條件，為蠶蛹蛋白的工業化生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 繅絲后的蠶蛹由廣東韶關翁源信達繭絲綢有限公司提供。原料的具體制備參照穆利霞等[14]的方法。

牛血清白蛋白由華美生物技術有限公司提供；Folin酚試劑由鼎國生物技術有限公司提供；氨基酸測定所用試劑為色譜純；其它所用試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 高速冷凍離心機（CR22G型，HITACHI，日本）；冷凍干燥機（ALPHA1-4/2-4型，德國）；精密pH計（320-S型，瑞士梅特勒-托利多儀器設備有限公司）；快速漩渦振蕩儀（MM-2型，江蘇省姜堰市沈高康建生化器具廠）；紫外/可見分光光度計（UV-2450，島津，日本）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責任公司）；凱氏定氮儀（KDN-08，上海新嘉電子有限公司）；脂肪酸測定儀（SOX416型，GERHARDT，德國）；超聲設備（JY92-IIN型，寧波新芝生物技術股份有限公司）；水分測定儀（MA型，賽多利斯，德國）；氨基酸分析儀（L-8900型，HITACHI，日本）。

1.2 方法

1.2.1 蠶蛹蛋白的堿法制備 將脫脂蠶蛹粉與一定濃度的浸提液按照一定液固比（V/m）充分混合均勻，在不同的超聲條件下處理，得到的混合液過300目篩除去蛹皮等不溶物，得到的濾液為蛋白浸提液。以1 mol/L的HCl調節蛋白浸提液pH值為4.5，于4 ℃靜置2 h，得到蛋白沉淀。沉淀在室溫以4 000 r/min離心15 min分離。重新懸浮沉淀，并以2 mol/L NaOH調節pH值為7.0，4 ℃透析24 h脫鹽（每4 h更換透析液）。脫鹽后的蛋白溶液冷凍干燥后得蠶蛹蛋白。

1.2.2 蠶蛹蛋白浸提條件的優化 以超聲功率（W）（X1）、超聲時間（min）（X2）、浸提的液固比（V/m）（X3） 和NaOH添加量（%）（X4）等四因素為自變量，以蠶蛹蛋白得率為響應值，設計了4因素3水平的中心組合試驗[15]。試驗各因素及其水平分別為：超聲功率（300～500 W），超聲時間（15～25 min），浸提液固比（V/m）（20 ∶ 1～60 ∶ 1），NaOH濃度（0.1%～0.5%）。將脫脂蠶蛹粉與試驗濃度的浸提液按照試驗體積比充分混合均勻，于試驗的超聲條件下處理。以考馬斯亮藍法測定過濾液中可溶性蛋白的含量[16]，并計算蛋白得率。計算公式如下：

蛋白得率=×100%

1.2.3 蠶蛹蛋白各指標的檢測 脫脂蛹粉及蠶蛹蛋白的各指標按照如下方法測定：水份測定采用常壓干燥法（GB/T14769-1993）；蛋白質含量采用凱氏定氮法（GB/T 14771-1993，Nx6.25）；脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T14772-1993）；灰分測定采用重量法（GB/T14770-1993）；總氨基酸組成采用Hitachi L-8900氨基酸分析儀進行測定，測定前用6 mol/L HCl于充氮管中充分酸水解（110 ℃，22 h）。

1.3 數據處理

數據采用SPSS統計分析軟件進行相關性分析，p<0.05為統計學上有顯著性差異；樣本數n≥3。

2 結果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 超聲功率對蛋白得率的影響 圖1結果表明，當超聲時間（10 min）和液固比（10 ∶ 1）恒定時，與對照相比，超聲處理能夠顯著改善蠶蛹蛋白的得率。在超聲功率為100 W時，得率比較低，在超聲輔助提取的條件下，蛋白得率明顯提高，當超聲功率大于400 W， 繼續增大超聲功率時，得率逐漸降低。

超聲功率是描述超聲能量輸入的一個重要指標，在介質相同的情況下，不同的功率會導致介質中不同的溫度變化，從而影響蛋白的溶出率；同時適當的超聲處理會改變蛋白的結構，從而改善蛋白的溶解性，增加蛋白的得率。而過高的功率會導致溶液的局部溫度增加過快，使溶出的可溶性蛋白重新聚集沉淀，使蛋白的得率在一定程度上有所降低。

2.1.2 超聲時間對蛋白得率的影響 圖2結果表明，在超聲功率（400 W）和液固比（10 ∶ 1）恒定的條件下，蠶蛹蛋白的得率隨著超聲時間的延長先升高后逐漸降低，這與超聲本身對蛋白的影響有關。在提取時間為5～20 min之間，提取效率逐漸增加，5～10 min增幅最大，20 min之后，時間越長，反而不利于蛋白的提取。湯虎等[10]的研究結果表明，在適當的超聲功率條件下，蛋白質的溶解性隨著超聲時間的延長出現先升高后降低的趨勢，這是因為在超聲波的作用下，蛋白質分子的結構變得疏松，蛋白質溶解性增加，隨著處理時間的延長，蛋白質展開的肽鏈重新聚集，蛋白的溶解性降低。

2.1.3 液固比對蛋白得率的影響 當超聲功率（400 W）和時間（20 min）恒定時，介質溶液的濃度直接會影響到超聲的作用效果[17]。圖3結果表明，在超聲功率和超聲時間恒定的條件下，隨著溶液中脫脂蛹粉濃度的增加，超聲協助堿法制備蠶蛹蛋白的得率先增加后變化不明顯。

提取時液固比過小時，蠶蛹中蛋白質不易從溶劑中被提出，故而蛋白的得率很低。提取液固比越大，蛋白質得率越大，這是由于蠶蛹蛋白多數為球蛋白，其蛋白溶解性低，因此增加溶劑的量能夠增加蛋白的得率。但液料比過大時，如液固比>40時，得率增長緩慢，這可能是因為過低的反應底物濃度導致提取過程中蛋白損失的比重增加，從而使蛋白的得率改善不明顯甚至略有降低。考慮到以上因素和工業生產的可行性，提取時液固比40 ∶ 1。超聲介質中蛋白的濃度會影響超聲波的作用效果，在適當的蛋白質濃度范圍內，超聲波的空化作用隨著蛋白含量的增大而增大，蛋白質分子的結構變得疏松，導致蛋白的溶解性發生變化，蛋白得率增加；當蛋白含量增大時，在相等時間內，超聲波空化作用減弱，過高的濃度導致相同時間內超聲波對反應體系的作用減弱，從而影響其產生特殊的物理化學效應[18]。

2.1.4 NaOH添加量對蛋白得率的影響 當超聲功率（400 W）、超聲時間（20 min）和液固比恒定（40 ∶ 1）時，適當提高溶液的pH值有利于增加蛋白的溶解性，因此NaOH濃度對蛋白的得率有一定的影響。圖4結果表明，隨著NaOH濃度的增加，蠶蛹蛋白的得率先增后減，當NaOH濃度在0.3%～0.5%之間時，蛋白得率達到最高。這是因為隨著NaOH濃度增加，溶液中OH-的數量增加，蠶蛹蛋白的溶解性也增加，但過高的NaOH濃度會造成蠶蛹蛋白的部分降解，使得浸提液中可溶性蛋白含量降低。

2.1.5 NaCl添加量對蛋白得率的影響 圖5結果表明，當超聲功率（400 W）、超聲時間（20 min）、液固比恒定（40 ∶ 1）和NaOH濃度（0.3%）恒定時，隨著NaCl濃度的增加，蠶蛹蛋白得率先增后減，但與對照相比，無明顯增加趨勢。浸提液中NaCl濃度的增加導致鹽的含量增加，促進了蛋白質在溶液中的鹽溶作用，過高的NaCl濃度會導致溶液中離子強度過高，蛋白質分子因帶電荷而產生的斥力使其溶解度降低。但在本研究中，NaCl的添加對蛋白得率并無顯著增加，因此，選擇不添加NaCl進一步開展研究。

2.1.6 底料溫度對蛋白得率的影響 由圖6結果可以看出，當超聲功率（400 W）、超聲時間（20 min）、液固比（40 ∶ 1）、NaOH濃度（0.3%）和NaCl添加量（0）恒定時，隨著提取體系溫度的升高，蠶蛹蛋白質的得率下降。這可能是因為底料溫度高，超聲過程中還有熱量的釋放，混合液溫度再次升高，從而使蛋白的結構發生更加劇烈的變化，造成原來可溶的蛋白再度變性聚集。此外，溫度過高，降溫時間延長，該過程也容易引起微生物的滋生，所以綜合考慮這些因素及節約能源消耗，底料溫度應控制在常溫（當時室溫在16～20 ℃）。

2.2 響應面分析優化提取條件及試驗結果

以影響顯著的單因素指標超聲功率（W）、超聲時間（min）、浸提的液固比（V/m）和NaOH添加量（%）的最佳處理條件為中心點，建立超聲協助蠶蛹蛋白浸提組合設計方案（表1），該條件在超聲初始溫度為常溫、不添加NaCl的條件下進行。

由Design-Expert7.0統計軟件的可知，蠶蛹蛋白制備的組合試驗共有29個處理，試驗結果列于表2。由數據可知，堿提法所得的蠶蛹蛋白得率在30.82%～87.03%之間。采用Design-Expert7.0統計軟件對表2試驗數據進行分析，建立響應面的回歸模型，進而尋求最優響應值的因素水平。以蛋白得率為響應值，回歸擬合后各因子對響應值的影響用以下方程表示：

蛋白得率/%=74.73-1.12X1+1.08X2+18.29X3+7.06X4-1.91X1X2-1.52X1X3-0.38X1X4+4.38X2X3-3.65X2X4-1.07X3X4-12.81X12-8.93X22-5.17X32-7.40X42

（式中X1、X2、X3、X4為各因素水平的代碼）。

從表3可以看出，液料比和NaOH添加量對蛋白得率影響顯著（p<0.05），超聲功率和時間對蛋白得率影響不顯著（p>0.05）。此外，各因素對蛋白得率的影響大小依次為：X3>X4>X1>X2。由表4可知：回歸方程的R2=0.926 5，失擬項不顯著（1.013 7>0.100 0），說明回歸方程的擬合程度較好，模型是顯著的。回歸模型的F-檢驗顯著，說明所擬合的二次回歸方程合適，該模型的預測值和實際值比較接近。

對超聲協助制備蠶蛹蛋白的蛋白得率的模型進行數學分析，優化的最佳處理條件為超聲功率391 W、超聲時間20.1 min、浸提的液固比（V/m）59.4 ∶ 1和NaOH添加量0.308%，所得到蛋白得率為87.97。考慮到可操作性，本研究選擇超聲功率400 W、超聲時間20 min、浸提的液固比（V/m）60 ∶ 1和NaOH添加量0.3%等條件對上述模型進行驗證，獲得的蛋白得率為88.14%，驗證結果與理論預測值接近。

2.3 蠶蛹蛋白的主要化學指標

利用優化工藝制備的蠶蛹蛋白的粗蛋白含量達92.30%，灰分含量4.19%，沒有檢測出粗脂肪，外觀淡黃，無明顯的蛹臭味，具有較好的感官色澤。

蛋白質的氨基組成和比例往往決定了它的性質和品質，本研究制備的蠶蛹蛋白的氨基酸含量及評分見表6，結果表明：蠶蛹蛋白的氨基酸評分均相對較高，接近甚至超過了FAO/WHO推薦標準[19]，因此可以作為食品基料來使用。

3 討論與結論

超聲波作為一種物理的手段和工具，有助于提取過程中蛋白的溶出，從而提高蠶蛹蛋白的得率。試驗得到的超聲協助堿法制備蠶蛹蛋白的數學模型，堿法制備蠶蛹蛋白的浸提條件中，液固比（V/m）和NaOH濃度對蠶蛹蛋白的得率影響顯著；通過響應面優化獲得蠶蛹蛋白的最佳制備工藝條件為：超聲功率400 W，超聲時間20 min，浸提液固比（V/m）60 ∶ 1，NaOH濃度0.3%。在此工藝條件下浸提，蛋白得率的實測值為88.14%，該得率顯著高于醇提法的8.47%[5]和普通堿提法的78.69%[6]。本研究制備的蠶蛹蛋白氨基酸比例基本符合FAO/WHO推薦標準，可以作為食品基料使用，為蠶蛹蛋白的規模化開發奠定了基礎。

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責任編輯：沈德發