NaCl預處理對鹽脅迫下水稻H2O2含量和過氧化氫酶活力的影響

高宇等

摘要

[目的]通過對水稻苗前期鹽的處理后，測定鹽脅迫條件下生理指標的變化，確定鹽害對水稻的影響。[方法] 測定了一種鹽敏感水稻品種（麗江新團黑谷）經(jīng)過低濃度鹽脅迫預處理后在鹽害條件下葉片和根中活性氧H2O2的產(chǎn)生和CAT活力。[結(jié)果] 50 mmol/L鹽脅迫能導致其葉片和根中H2O2含量顯著上升，而CAT活力則顯著下降。經(jīng)過低濃度鹽（20 mmol/L）預先處理的水稻在鹽脅迫下H2O2含量上升幅度則較小，而CAT活力較高。此外，鹽脅迫預處理的水稻在鹽害條件下生長情況更好，其葉片中葉綠素含量更高。[結(jié)論] 活性氧H2O2及其清除酶CAT參與水稻對鹽害的應答反應，并且這種預處理能增強水稻抗鹽害脅迫能力。

關(guān)鍵詞水稻；鹽害；過氧化氫；過氧化氫酶；預處理

中圖分類號S511文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12814-02

Effects of NaCl Pretreatment on H2O2 Content and Catalase Activity of Rice under Salt Stress

GAO Yu1，2，XU Chunying1，WANG Dan1， JIN Xuehui1* et al

（1.Agricultural College， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing ，Heilongjiang 163319； 2.Heilongjiang Daqing Academy of Science， Daqing， Heilongjiang 163712）

Abstract[Objective]In order to study the effects of salt injury to rice， based on early rice seedlings after pretreatment of salt， the changes of physiological indexes under salt stress were determine. [Method]The salt sensitive rice variety of LTH was pretreated by low concentration of salt stress. And H2O2 content and catalase activity in the leaves and the roots were studied. [Result] 50 mmol/L salt stress could significantly increase H2O2 content in the leaves and the roots， but significantly decrease CAT activity. The rise of H2O2 content of rice pretreated by low concentration of salt stress （20 mmol/L） was low， but that of CAT activity was high. Otherwise， the growth of the rice pretreated by salt stress under the condition of salt stress was good， and chlorophyll content in the leaves was higher. [Conclusion] H2O2 and CAT were engaged in the response reaction of rice to salt stress. And the pretreatment could improve the salt stress resistance of rice.

Key wordsRice； Salt stress； Hydrogen peroxide； Catalase； Pretreatment

在植物生長過程中，其細胞在生理活動中不可避免地產(chǎn)生活性氧分子，如單線態(tài)氧、超氧陰離子、過氧化氫以及羥自由基等。這些活性氧會對植物的生物大分子造成傷害，但植物在億萬年進化過程中會產(chǎn)生活性氧自由基防衛(wèi)系統(tǒng)如抗氧化酶（如清除H2O2的過氧化氫酶）和大分子抗氧化物質(zhì)（如抗壞血酸等），從而將活性氧自由基的危害降低到最低程度。各種環(huán)境脅迫因子如干旱、鹽害、強光等都能導致植物細胞中活性氧的過度產(chǎn)生[1]。我國有大量鹽堿地，對農(nóng)作物生長有明顯的危害作用，如抑制植物生長，作物產(chǎn)量下降。水稻是一種鹽敏感植物，也是我國主要的農(nóng)作物之一。前人發(fā)現(xiàn)，離體水稻葉片在鹽害作用下H2O2沒有顯著上升。此外，對于水稻植物在鹽害條件下H2O2是否會上升有不同的結(jié)論，如鹽敏感水稻H2O2會顯著上升，而鹽抗性水稻H2O2上升并不明顯。然而，在自然界中很少有抗鹽水稻品種。這里，筆者對一種鹽敏感水稻品種（麗江新團黑谷）用低濃度NaCl預處理后，試圖導致其抗鹽能力增強，同時研究了后天鹽害預處理的水稻在鹽害條件下，其活性氧如H2O2產(chǎn)量及其主要清除酶過氧化氫酶（CAT）活性。該研究工作會促進人們對水稻在鹽害條件下活性氧代謝產(chǎn)生新的認識。

1材料與方法

1.1植物材料培養(yǎng)及處理

將水稻品種麗江新團黑谷先用濃度0.5%次氯酸鈉消毒液處理10 min，然后置于清水中24 h讓其發(fā)芽。接著，轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中使其生長，光照條件為12 h/12 h，75%濕度下生長。待長到2片葉后，將一部分水稻幼苗用20 mmol/L NaCl預處理24 h，對照為清水處理。然后，將水稻苗重新轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中培養(yǎng)生長48 h。挑選健康和大小一致的2種處理后水稻苗（鹽預處理和對照處理的）進行鹽害（50 mmol/L NaCl）處理24 h，對照為清水處理。最后，將處理后的水稻苗挑選出來，用自來水輕輕沖洗干凈，用于H2O2含量和CAT活力測定。

1.2試驗方法

1.2.1葉綠素含量測定。

葉綠素含量測定采用丙酮提取，分光光度法測定[2]。

1.2.2H2O2含量測定及染色。

利用FOX法測定H2O2的含量。其原理是在酸性環(huán)境下，氫過氧化物（包括H2O2）能將Fe2+氧化成Fe3+，后者與二甲酚橙反應生成一種紫藍色的復合物。該復合物在560 nm處有最大吸光值。該方法操作簡單，重復性強，靈敏性高[3]。

DAB即二氨基聯(lián)苯胺，能與H2O2在過氧化物酶催化下生成一種紅棕色物質(zhì)。具體染色步驟為：將葉片浸泡在1 mg/ml DAB溶液中（pH 7.0，DAB事先須溶解在pH 3.8的緩沖液中，低pH環(huán)境有利于DAB完全溶解）。然后，置于有光照的溫室中8 h。將葉片置于濃度95%的沸騰乙醇中脫色5～10 min，可直接看到紅棕色斑點。這就是H2O2與DAB反應的產(chǎn)物[4]。

1.2.3CAT酶抽提及測定。

將植物待測葉片在液氮中研成粉末，用10倍體積的抽提緩沖液抽提。緩沖液配方如下：01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.5），內(nèi)含濃度1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2。在10 000 g條件下離心20 min，上清液在-20 ℃冰箱中保存，待測。在1 ml反應液（10 mmol/L PBS緩沖液，pH 7.0，10 mmol/L H2O2）中加入適量上述酶抽提液，迅速混勻，在240 nm波長處測定吸光值[5]。蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍染色法[6]。

2結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫對水稻葉片葉綠素含量的影響

經(jīng)過水浸根處理和30 mmol/L NaCl浸根處理[7]，分別設不加100 mmol/L NaCl和加100 mmol/L NaCl處理。由圖1可知，鹽脅迫處理后，經(jīng)過水浸根處理，分別加100 mmol/L NaCl葉片（C1）與不加100 mmol/L NaCl（C0）葉片比較，葉片中葉綠素含量明顯呈下降趨勢。而經(jīng)過水浸根處理與鹽30 mmol/L NaCl浸根處理不加100 mmol/L NaCl處理的葉片（S0）比較，葉片中葉綠素含量依舊呈下降趨勢，但是隨著鹽脅迫的加強以及時間的延長，葉片（S1）中葉綠素含量反而呈上升趨勢，甚至超過C0處理葉片葉綠素含量水平。這說明鹽脅迫對該品種水稻葉綠素含量有較大的影響。

2.2鹽脅迫對水稻葉片中H2O2含量的影響

研究表明，H2O2含量隨著NaCl脅迫的加大而增加，但是增加趨勢緩慢，30 mmol/L NaCl浸根處理取得的葉片H2O2含量會稍低于水浸根處理加100 mmol/L NaCl葉片，30 mmol/L NaCl浸根處理加100 mmol/L NaCl處理的葉片H2O2含量會稍有增加，但是幅度不大。針對該試驗方案測試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對該品種水稻葉片H2O2含量的影響很小[8]。

2.3鹽脅迫對水稻葉片CAT活性的影響

該試驗設水浸根處理和30 mmol/L NaCl浸根處理，分別設不加100 mmol/L NaCl和加100 mmol/L NaCl處理，共進行4個處理。由圖2可知，CAT活性大小順序為CS0（水浸根處理不加鹽處理）< CS1（水浸根處理加鹽處理）< SS0（30 mmol/L NaCl浸根處理不加鹽處理）< SS1（30 mmol/L NaCl浸根處理加鹽處理）。由此可知，鹽脅迫對水稻CAT活性有較大的影響，而當在鹽脅迫環(huán)境下“鍛煉”后，CAT活性受影響不大，說明水稻有一定的耐鹽性[9]

3結(jié)論與討論

鹽脅迫能干擾植物細胞中活性氧（ROS）產(chǎn)生與清除之間的平衡，導致植物細胞遭受氧化脅迫傷害。在正常條件下，植物細胞中產(chǎn)生的ROS與其清除系統(tǒng)保持這一動態(tài)平衡，而當植物受到環(huán)境脅迫而使得產(chǎn)生的ROS量超出其清除能力時，就會引起ROS累積產(chǎn)生氧化傷害，導致生物膜脂過氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA鏈斷裂及光合受阻等多種有害現(xiàn)象的出現(xiàn)，使得細胞功能紊亂，機體出現(xiàn)各種氧化損傷毒害。水稻對鹽害脅迫相當敏感[10-13]。前人研究顯示，抗性水稻品種在鹽害作用下葉片組織中H2O2含量并沒有顯著的改變。然而，鹽敏感水稻品種在鹽害脅迫下H2O2含量會顯著上升[14-16]。此外，離體水稻葉片在鹽脅迫下H2O2含量也不會顯著上升[17]。研究中，麗江新團黑谷是鹽敏感品種，鹽害導致其H2O2含量稍有上升。而CAT作為水稻種一種關(guān)鍵的H2O2清除酶，研究中鹽害導致其酶活力顯著下降[18]。考慮到多數(shù)水稻品種是鹽敏感品種，而我國又有很大面積的鹽堿地，通過非轉(zhuǎn)基因手段獲得抗鹽能力的水稻研究顯得很重要。研究中，通過鹽預處理該敏感水稻品種，發(fā)現(xiàn)其抗鹽能力獲得顯著增強。這可從生長狀態(tài)和葉綠素水平獲得驗證。此外，H2O2產(chǎn)生量相對于對照也稍有上升，而其原因之一可能與其CAT酶活力獲得“鍛煉”，在鹽脅迫條件下能保持較高活力有關(guān)。

綜上所述，對鹽敏感的麗江新團黑谷利用低濃度鹽預處理后，該水稻品種在較高鹽害條件下其抗性獲得顯著上升。由鹽脅迫誘導的H2O2產(chǎn)生量明顯降低，而且能保持較高的CAT酶活力。該研究可為通過體外施加化學試劑增強水稻抗鹽能力提供部分理論依據(jù)。

參考文獻

[1] BRADFORD M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Anal Biochem，1976，72：248-254.

[2] HEATH R L，PACKER L.Photoperoxidation in isolated chloroplast.I.Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J].Arch Biochem Biophys，1968，125：180-198.

[3] GAY C，COLLINS J，GEBICKI J.Hydroperoxide assay with the ferricxylenol orange complex[J].Anal Biochem，1999，273：149-155.

[4] THORDALCHRISTENSEN H，ZHANG Z，WEI Y，et al.Subcellular localization of H2O2 in plants.H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barleypowdery mildew interaction[J].Plant J，1997，11：1187-1194.

[5] ZHANG J，KIRKHAM M.Droughtstressinduced changes in activities of superoxide dismutase，catalase，and peroxidase in wheat species[J].Plant Cell Physiol， 1994，35：785-791.

[6] ZAKA R，VANDECASTEELE C，MISSET M.Effects of low chronic doses of ionizing radiation on antioxidant enzymes and G6PDH activities in Stipa capillata（Poaceae）[J].J Exp Bot， 2002，53：1979-1987.

[7] LIU C L， DU W C，CAI H S，et al.Trivalent chromium pretreatment alleviates the toxicity of oxidative damage in wheat plants exposed to hexavalent chromium[J].Acta Physiol Plant， 2014，36：787-794.

[8] DENG B L，DONG H S.Ectopic expression of riboflavinbinding protein gene TsRfBP paradoxically enhances both plant growth and drought tolerance in transgenic Arabidopsis[J].J Plant Growth Regul， 2013，32：170-181.

[9] DENG B L.Antioxidative response of golden agave leaves with different degrees of variegation under high light exposure[J].Acta physiol Plant， 2012，34：1925-1933.

[10] MITTLER R.Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J].Trends Plant Sci， 2002，7：405-410.

[11] GILL S，TUTEJA N.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J].Plant Physiol Biochem， 2010，48：909-930.

[12] AMIRJANI M.Effect of NaCl on some physiological parameters of rice[J].Eur J Biol Sci， 2010，3：6-16.

[13] LEE D，KIM Y，LEE C.The inductive responses of the antioxidant enzymes by salt stress in the rice（Oryza sativa L.）[J].J Plant Physiol，2001，158：737-745.

[14] LIN C，KAO C.Effect of NaCl stress on H2O2 metabolism in rice leaves[J].Plant Growth Regul， 2000，30：151-155.

[15] VAIDYANATHAN H，SIVAKUMAR P，CHAKRABARTY R，et al.Scavenging of reactive oxygen species in NaClstressed rice（Oryza sativa L.）differential responses in salttolerant and sensitive varieties[J].Plant Sci， 2003，165：1411-1418.

[16] WILLEKENS H，CHAMNONGPOL S，DAVEY M，et al. Catalase is a sink for H2O2 and is indispensable for stress defence in C3 plants[J].EMBO J， 1997，16：4806-4816.

[17] SHIM I，MOMOSE Y，YAMAMOTO A，et al. Inhibition of catalase activity by oxidative stress and its relationship to salicylic acid accumulation in plants[J].Plant Growth Regul， 2003，39：285-292.

[18] QUAN L，ZHANG B，SHI W，et al. Hydrogen peroxide in plants：a versatile molecule of reactive oxygen species network[J].J Integr Plant Biol， 2008，50：218.