紅三葉草固態發酵物對肉仔公雞免疫機能的影響

孟翠紅　張福元

摘要

[目的]利用紅三葉草固態發酵物飼喂肉仔公雞，分析紅三葉草固態發酵物對其免疫機能的影響。[方法] 選用1日齡健康艾維茵肉仔公雞600只隨機分為5組，在基礎日糧中添加0.1%、0.2%、0.3%紅三葉草固態發酵物（RSF）和紅三葉草提取物，研究發酵紅三葉草對肉仔公雞免疫機能的影響。[結果] 28日齡，0.1%RSF組肉仔雞T、B淋巴細胞增殖反應比對照組分別提高9.1%和8.3%（P<0.05）。在基礎日糧中添加0.1%、0.3%RSF和紅三葉草提取物均能顯著提高肉仔雞的胸腺指數（P<0.05）。在基礎日糧中添加0.1%RSF能顯著提高49日齡肉仔雞的脾臟指數（P<0.05）。 在基礎日糧中添加0.1%RSF和紅三葉草提取物均顯著提高22日齡肉仔雞的法氏囊指數（P<0.05）。[結論] 該研究可為利用米曲霉固態發酵紅三葉生產飼料添加劑提供理論依據。

關鍵詞紅三葉固態發酵；肉仔雞；免疫機能

中圖分類號S541+.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12915-03

Abstract [Objective] The male broilers were fed with red cloversolid state fermentation to analyze their effects on the immune functions of male broilers. [Method] 600 onedayold healthy male Avian broilers were randomly divided into 5 groups. 0.1 %， 0.2%， 0.3% red cloversolid state fermentation （RSF） and red clover extract were added in the basal diet to study the effects of red cloversolid state fermentation on the immune functions of male broilers. [Result] The proliferation rates of T and B lymphocytes 28dayold broilers in 0.1% RSF group increased 9.1% and 8.3% than that in control group（P<0.05）. The thymus index of broilers could be significantly increased by adding 01%，0.3% RSF and red clover extract in the basal diet（P<0.05）. Adding 0.1% RSF in the basal diet could significantly increase the spleen index of 49dayold broilers（P<0.05）. Adding 0.1% RSF and red clover extract in the basal diet could significantly increase the fabricius index of 22dayold broilers（P<0.05）. [Conclusion] The research could provide theoretical basis for producing feed additives with solidstate fermentation products of red clover with Aspergillus oryzae.

Key words Red cloversolid state fermentation （RSF） ； Broilers； Immune function

紅三葉草，又名紅車軸、紅荷蘭翹搖等，是豆科三葉草屬多年生草本植物。紅三葉草在我國吉林、新疆、湖北山地、云貴高原等地區都有野生分布，在我國江淮流域、華南、西南等地區均有栽培，是我國長江流域以南及甘肅省高寒陰濕地區優良的豆科牧草[1]。研究表明，紅三葉含有豐富的異黃酮類物質（如芒柄花素、鷹嘴豆芽素A、紅車軸草素、大豆素等[2]），具有植物雌激素和抗氧化的生理活性功能[3-5]，能促進動物生長，增強機體免疫力，調節動物繁殖等[6-7]。

紅三葉草雖然含有豐富的異黃酮，但是由于植物細胞壁的高纖維結構會阻礙異黃酮從細胞內滲出進入腸道內，從而使異黃酮還未滲出利用就已隨著糞便排出，使得異黃酮的利用率大大降低。米曲霉是梗孢科曲霉屬中常見的一個真菌種，是我國傳統釀造食品醬和醬油的生產菌種，也可用于生產淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和曲酸等[8]。研究表明，米曲霉發酵所產纖維素酶的活性高[9]，利用米曲霉的這個特性發酵紅三葉草，制得集纖維素酶與異黃酮于一體的發酵物，既可使異黃酮在動物體內被充分利用，又有助于飼料中的纖維素和其他成分的消化。另外，用曲霉菌固態發酵紅三葉草產纖維素酶的研究表明，經過發酵后的紅三葉內異黃酮的滲出力提高了近1倍[10]。筆者利用紅三葉草固態發酵物飼喂肉仔公雞，通過對其免疫機能的影響研究，旨在為利用米曲霉固態發酵紅三葉生產飼料添加劑提供理論依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

紅三葉草購自甘肅岷海制藥有限公司，40目粉碎，測得總黃酮含量為2.2%。

紅三葉草固態發酵物（Redcloversolidstatefermentation，RSF）是利用米曲霉A.niger 3.3148菌株（產纖維素酶活高）在最佳發酵條件下發酵紅三葉草，14 d后低溫干燥制得。實際測得發酵物中含纖維素酶2 000 U/g、果膠酶1 560 U/g、糖化酶396 U/g、酸性蛋白酶196 U/g、米曲霉活菌數為5.3×106 cfu/g，總黃酮含量為2.3%。

紅三葉草提取物購自蘭州天萃生物技術有限公司，其主要成分為刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素A、染料木素及大豆素，總黃酮含量為98%。

BrduELISA試劑盒為Biochringer Mannheim公司產品，Percoll細胞分層液為Pharmacia公司產品，RPMI-1640培養基為Gibcobrl公司產品，LPS（細菌脂多糖）和ConA（刀豆素A）為Sigma公司產品。

1.2試驗動物及基礎日糧

試驗選用600只1日齡健康的艾維茵肉用公雛，平均體重為（40.39±1.48）g，將其隨機分為5個試驗組，每組3個重復，每個重復40只雞。

基礎日糧以玉米-豆粕為主要原料，分生長前期（0～3 w）和生長后期（4～7 w）2個階段配制試驗日糧，各處理組除添加物及劑量不同外，其他營養水平相同。各處理組基礎日糧配方及營養水平見表1～2。

1.3試驗設計

試驗采用完全隨機設計，共分5個試驗組，分別為基礎日糧對照組（Ⅰ組）、基礎日糧+0.1%RSF（Ⅱ組）、基礎日糧+0.2%RSF （Ⅲ組）、基礎日糧+0.3%RSF （Ⅳ組）、基礎日糧+20 mg/kg紅三葉草提取物（Ⅴ組），試驗期7 w。

1.4飼養管理

分3層籠養，雞舍采用暖氣供熱，第1周室溫為33～35 ℃，以后每天降溫0.5 ℃左右，從第5周開始環境溫度可保持在20～24 ℃。自由采食飲水。3日齡以前24 h光照，4～15日齡12 h光照，以后每周增加4 h光照時間，從第5周開始給予23 h光照和1 h黑暗至結束。光照強度第1～2周為10 lx，第3周可降到5 lx至出欄。7日齡時第1次注射新城疫弱毒苗進行首次免疫，14日齡采用飲水進行法氏囊疫苗免疫，21日齡采用飲水進行新城疫弱毒苗二次免疫。試驗期間，經常觀察雞群采食飲水、糞便以及精神狀況，做好稱料和死亡等記錄。

1.5測定項目與方法

1.5.1

T、B淋巴細胞轉化率。于28日齡清晨從各處理組中取體重相近的健康雞3只，無菌心臟采血（外周）血，用肝素抗凝。采用Percoll細胞分層液來分離淋巴細胞。將制備好的淋巴細胞加入到96孔細胞培養板中，50 μl/孔，以ConA和LPS分別作為T、B淋巴細胞絲裂源，濃度分別為45.0和22.5 μg/ml，每個處理3個復孔，置于40 ℃ 5% CO2培養箱中培養，細胞培養60 h后，每孔加入10 μl Brdu標記二抗及顯色，具體步驟按照試劑盒要求進行，最后使用318MC酶標儀測定T、B淋巴細胞增殖OD450 nm值。

1.5.2

免疫器官指數。22、36、49日齡清晨從各處理組隨機取體重均一的健康雞6只，進行屠宰，摘取其左側胸腺、脾臟和法氏囊，用吸水紙吸干，剔除脂肪后稱量鮮重，計算免疫器官絕對重量及指數，以g/kg體重表示。

1.6數據處理

采用SPSS （10.0） 軟件的ONEWAY ANOVA進行方差齊次性檢驗，再進行F 檢驗和LSD多重比較。

3 討論與結論

淋巴細胞（T淋巴細胞和B淋巴細胞）與機體的免疫有極密切的關系，B細胞可轉變為漿細胞，抗體主要是由漿細胞合成并分泌到血漿中的。T細胞本身雖不直接產生抗體，但它可與B細胞合作幫助B細胞產生抗體。Zyla等[10]發現添加黑曲霉菌絲體（A.niger FM）使法氏囊重增加，顯著減少了腸系膜派爾氏（Peyers）淋巴結。郭曉紅等用大豆異黃酮對肉仔雞生產性能及免疫性能的研究表明異黃酮能夠提高抗體水平和T淋巴細胞增殖[11]。該試驗發現各試驗組均顯著提高了B淋巴細胞增殖反應，但隨著添加水平的提高有降低B淋巴細胞增殖的趨勢，添加0.1%和0.2%的RSF顯著提高了T淋巴細胞增殖反應，說明RSF能調節肉仔雞免疫機能，增強了ConA和LPS對淋巴細胞刺激的反應性，從而提高肉仔雞免疫力，這與邱榮斌等[12]研究結果相一致。

胸腺產生的胸腺素T細胞成熟的效應因子，可促進合成具有胸腺素依賴的IL2受體，調節IL2在免疫系統中的作用[13]。該試驗中高濃度的RSF對肉仔雞生長初期胸腺指數影響顯著，但是隨著肉仔雞的生長，高濃度RSF對肉仔雞胸腺指數的影響降低，而低濃度RSF對胸腺指數的作用卻有所提高，說明高濃度RSF在肉仔雞生長初期能夠促進胸腺素的產生，但是在生長后期反而抑制胸腺素的分泌。

脾臟是雞體內最大的免疫器官，參與細胞免疫和體液免疫，脾臟重量的提高在某種程度上反映了動物機體的免疫水平[14]。該試驗發現0.1%RSF顯著提高了49日齡脾臟指數，表明RSF降低死淘率作用原因之一是由于提高了脾臟器官重量，但突出表現在生長后期。0.2%RSF降低了脾臟器官重量，可能是因為其在前期造成的免疫損傷一直持續到生長后期所致。

法氏囊是雞重要的免疫器官，添加0.1% RSF提高前期成活率，可能與其提高法氏囊指數相關。36日齡和49日齡，各試驗組肉仔雞法氏囊指數無顯著差異，這可能與法氏囊隨日齡的增長而逐漸萎縮有關。

RSF對肉仔雞免疫機能有調節作用，0.1%RSF提高了T、B淋巴細胞增殖反應，較對照組分別提高9.1%和8.3%。在生長全期提高了肉仔雞胸腺指數，較對照組分別提高217%、26.2%和19.1%。在生長后期提高了肉仔雞脾臟指數，較對照組提高35.9%，說明添加0.1% RSF能增加脾臟器官重，生長后期表現突出。生長前期提高了肉仔雞法氏囊指數，對照組提高32.0%，生長后期各試驗組在法氏囊指數上無顯著差異（P>0.05），這與法氏囊隨日齡增長逐漸萎縮有關。但隨著RSF添加水平的提高，并沒有進一步提高肉仔雞免疫機能，添加0.2%RSF反而降低了49日齡脾臟指數，添加0.3%RSF沒有進一步降低反而有所緩和。這可能是因為高劑量異黃酮造成了免疫抑制，而沒有進一步降低可能是由于米曲霉菌的調節作用。

42卷36期孟翠紅等紅三葉草固態發酵物對肉仔公雞免疫機能的影響

參考文獻

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