H5N1亞型禽流感病毒在MDCK細胞中增殖條件的研究

孫德君等

摘 要：目的：探索H5N1亞型禽流感病毒在MDCK中增殖規(guī)律，確定最佳增殖條件。方法 將H5N1亞型禽流感病毒接種到6孔板培養(yǎng)的MDCK細胞進行增殖試驗，檢測不同病毒感染量、不同濃度TPCK-胰酶，接毒后不同時間病毒的HA滴度。根據(jù)確定的最佳增殖條件將病毒接種到微載體培養(yǎng)的MDCK細胞中進行大規(guī)模增殖。結(jié)果：最佳病毒增殖條件接毒量MOI為5×10-4、TPCK-胰酶濃度為4 μg/mL，在5 L 生物反應器中重復驗證，獲得穩(wěn)定的試驗結(jié)果，病毒血凝價最高為8 log2。結(jié)論：本研究為禽流感疫苗的生物反應器規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：H5N1亞型禽流感病毒；MDCK細胞；規(guī)模化培養(yǎng)

Abstract： To explore the regularity for the multiplication of avian influenza virus subtype H5N1 in MDCK cell culture system and determine the optimal proliferation conditions. H5N1 subtype of avian influenza virus was inoculated into the MDCK cell growing on 6 well plate， and the HA titers of virus at different time were detected in the conditions of different infectious doses， and different concentrations of TPCK-trypsin. The optimal conditions were determined. Then the H5N1 subtype avian influenza virus was grown in microcarrier-based MDCK cell. It was demonstrated that high virus yield with a hemagglutination unit of 8 log2（1∶256） could be obtained under the optimal conditions of multiplication. The result indicated the H5N1 subtype avian influenza virus could be produced in microcarrier-based MDCK cell in a large-scale culture system with a high virus yield and demonstrates the feasibility of the development of mammalian cell-based in influenza vaccine in microcarrier culture systems.

Keywords： H5N1 subtype avian influenza；Madin-Darbin canine kidney （MDCK） cell； large-scale culture

從首次發(fā)現(xiàn)禽流感病毒至今，世界上很多國家都大規(guī)模爆發(fā)過禽流感疫情，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失。我國是禽流感病毒高爆發(fā)區(qū)，農(nóng)業(yè)部要求對雞、鴨、鵝等家禽實施強制免疫，這就需要大量高效、安全、低成本的禽流感疫苗。目前市場上大部分疫苗仍為雞胚制備，這種疫苗生產(chǎn)需要消耗大量的SPF雞胚，且勞動強度大、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量不穩(wěn)定，不利于應對大規(guī)模的禽流感疫情爆發(fā)。與傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)方法相比，動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感方法具有很多優(yōu)勢，如抗原匹配性好，可以進行大規(guī)模生產(chǎn)和縮短生產(chǎn)周期，自動化控制，減少過敏反應等。研究證明，禽流感病毒在犬腎傳代細胞（MDCK）上具有良好的適應性，用其培養(yǎng)禽流感病毒獲得的病毒滴度較高。實驗中對H5N1亞型禽流感病毒在MDCK細胞中的增殖條件進行探索，以期篩選規(guī)模化培養(yǎng)流感病毒的最適條件，為建立新型流感疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 細胞和病毒

禽流感H5N1亞型病毒株購自哈爾濱獸醫(yī)研究所，血凝價為9 log2（1∶512）；MDCK細胞系由北京清大天一科技有限公司提供。

1.2 主要試劑

培養(yǎng)基DMEM和胰酶購自GIBCO公司；國產(chǎn)新生牛血清購自濟南勁牛生物材料有限公司；TPCK-胰酶購自Sigma公司；微載體Cytodex-1購自GE公司；1%雞紅細胞懸液有作者實驗室制備。

1.3方法

1.3.1 禽流感病毒在細胞6孔板中增殖培養(yǎng)

1.3.1.1 病毒感染復數(shù)的確定

取長成單層MDCK細胞的6孔板，以不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，將禽流感病毒以不同的MOI（1×10-3、5×10-4、1×10-4、5×10-5）分別接種于MDCK細胞，加入TPCK-胰酶濃度為2 μg/mL的病毒維持液繼續(xù)培養(yǎng)。每隔12 h取細胞上清，按照微量紅細胞凝集試驗檢測病毒的HA滴度。

1.3.1.2TPCK-胰酶濃度的確定

按照1.3.1.1中的步驟將病毒以MOI為5×10-4接種于MDCK細胞，分別加入TPCK-胰酶濃度為0、2、4、6和8 μg/mL的病毒維持液繼續(xù)培養(yǎng)。每隔12 h取細胞上清，按照微量紅細胞凝集試驗檢測病毒的HA滴度。

1.3.2 禽流感病毒在生物反應器中增殖培養(yǎng)

根據(jù)6孔板中摸索的病毒培養(yǎng)條件，在5 L反應器中驗證MDCK細胞的微載體培養(yǎng)工藝的可行性。微載體用量為4 g/L，細胞接種密度為4×105 cells/mL，細胞在微載體上培養(yǎng)72 h后，棄去培養(yǎng)液，按MOI為5×10-4將病毒液加入微載體細胞懸液中，補加TPCK-胰酶濃度為4 μg/mL的病毒維持液。每12 h取樣，觀察微載體上細胞吸附和生長情況，并用微量紅細胞凝集試驗檢測病毒的HA滴度。

2 結(jié)果

2.1 禽流感病毒在細胞6孔板中增殖培養(yǎng)

2.1.1 感染復數(shù)對禽流感病毒增值的影響

當接種病毒的MOI為5×10-5時，由于病毒感染量低而使增值速度降低，無法達到較高的血凝價。當接種病毒的MOI大于1×10-4時，病毒均可以大量增殖，其中MOI為5×10-4時，病毒的HA滴度較高，最高值為8 log2，結(jié)果見表1。

2.1.2 TPCK-胰酶濃度對禽流感病毒增值的影響

MDCK細胞接種禽流感病毒后，隨TPCK-胰酶濃度的增高，可明顯提高細胞增殖病毒的血凝效價；但TPCK-胰酶濃度過高，由于發(fā)生細胞脫落，病毒HA血凝滴度逐漸降低。當TPCK-胰酶濃度為4 μg/mL時，病毒HA滴度在接毒后48 h達到最高值9 log2。結(jié)果見表2。

2.2禽流感病毒株的規(guī)模化培養(yǎng)結(jié)果

在反應器中采用微載體進行禽流感病毒擴大培養(yǎng)，每12 h從反應器中取樣觀察并進行細胞計數(shù)，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示：接毒前細胞呈致密狀，細胞明亮，培養(yǎng)基中漂浮的游離細胞少，沒有細胞碎片存在。細胞計數(shù)結(jié)果顯示到達72 h時微載體上細胞已長成致密單層，細胞計數(shù)結(jié)果為3.5×106 cells/mL。接種禽流感病毒 24 h后，開始出現(xiàn)細胞病變，主要變現(xiàn)為細胞逐漸從微載體表面脫落下來，隨著培養(yǎng)時間的延長，脫落細胞增多，病毒維持液略顯混濁，48 h后絕大多數(shù)細胞從微載體上脫落，而且形態(tài)發(fā)生改變，同時大部分的微載體顆粒變成空球。由表3可知，病毒HA滴度在接毒后48 h即達到最高值，最高值為8 log2。

3 討論

利用動物細胞生產(chǎn)禽流感疫苗，可以在短期內(nèi)大規(guī)模增殖病毒，在疫情爆發(fā)時提供足夠的疫苗產(chǎn)品的，還降低了由于病毒在雞胚中連續(xù)傳代而引起基因發(fā)生突變的概率，使免疫效果更為可靠。MDCK細胞生產(chǎn)疫苗的生物安全性已經(jīng)得到各國的廣泛認可。

本試驗中禽流感病毒接種MDCK細胞，在胰酶作用下進行循環(huán)增殖，適當?shù)牟《窘臃N量，可以很好的實現(xiàn)病毒增殖。當病毒接種量過多時，細胞在病毒感染下很快死亡，同時還可能會產(chǎn)生干擾缺損病毒，限制病毒的多循環(huán)感染[1]；當病毒接種過少時，病毒要經(jīng)過多次循環(huán)復制，達到血凝滴度峰值的時間延長，病毒生產(chǎn)過程減慢。

胰酶可使不具感染性的非裂解型血凝素變?yōu)橛懈腥拘缘难兀瑥亩龠M病毒在細胞中的增殖。細胞維持液中不含有蛋白水解酶，無法裂解病毒血凝素，因此要適當加入胰酶，來提高病毒滴度[2]。本實驗中，隨著胰酶濃度的增加，促進了病毒在細胞間的循環(huán)感染，病毒滴度逐漸升高。但當胰酶濃度含量超過4 μg/mL時，病毒的滴度有下降的趨勢，可能是由于胰酶對病毒有一定的破壞，也有可能是胰酶濃度過高對細胞有一定的損傷作用。

動物細胞培養(yǎng)中生物反應器規(guī)模化培養(yǎng)技術(shù)是日趨成熟的一種技術(shù)，已經(jīng)用于多種疫苗的生產(chǎn)，如狂犬病疫苗[3]、藍耳疫苗[4]、黃熱病毒疫苗[5]等。國外疫苗生產(chǎn)企業(yè)的生物反應器規(guī)模化培養(yǎng)技術(shù)水平已經(jīng)達到能夠放大至6 t自動控制的規(guī)模，而國內(nèi)生物反應器規(guī)模化培養(yǎng)技術(shù)應用于獸用疫苗才剛剛起步，培養(yǎng)工藝、培養(yǎng)規(guī)模遠落后于國外。本試驗對H5N1亞型禽流感病毒增殖的條件進行了研究，確定最佳病毒增殖條件是接毒量MOI為5×10-4、TPCK-胰酶濃度為4 μg/mL，在5 L生物反應器中重復驗證，獲得穩(wěn)定的試驗結(jié)果，病毒血凝價最高為8 log2。本研究為禽流感疫苗的生物反應器規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

（編輯：狄慧）

參考文獻：

[1] Audsley JM， Tannock GA. The growth of attenuated influenza vaccine donor strains in continuous cell lines[J]. Journal of Virological Methods， 2005， 123（2）：187-193.

[2] 周伯平， 黎毅敏， 陸普選. 人禽流感[M]. 北京：科學出版社， 2007.

[3] ROUROU S， VAN DERARK A， MAJOUL S， et al. A novel animal-component-free medium for rabies virus production in Vero cells grown on Cytodex 1 microcarriers in a stirred bioreactor[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2009， 85（1） ：53-63.

[4] 馮 磊， 褚 軒， 吳培培. Marc-145 細胞微載體懸浮培養(yǎng)及 PRRSV 增殖工藝的[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報， 2012， 28（3） ： 589-603.

[5] SOUZA M C， FREIRE M S， SCHULZE E A， et al. Production of yellow fever virus in microcarrier-based Vero cell cultures[J]. Vaccine， 2009， 27（46） ： 6420-6423.