利用優化的SSR分子標記技術檢測雜交水稻萬優481純度

黃成志　雷樹凡　胡景濤　呂直文　黃文章　嚴明建　冉彥秀

摘要[目的]通過降低試驗藥劑、減少PCR循環時間、提高瓊脂糖利用指數等，建立經濟、快速、低污染的雜交水稻純度鑒定體系。[方法]將雜交水稻萬優481、親本萬3A和萬恢481在光照培養箱內溫度發芽（30 ℃，長到5 cm左右），用CTAB法提取DNA；按優化的PCR體系和電泳方法，用親本萬3A和萬恢481的DNA從24對引物中篩選出多態性好的引物P18，用引物P18對雜交水稻萬優481樣本進行純度鑒定。[結果]利用優化的SSR分子標記技術準確鑒定出萬優481的純度為98.5%，與田間鑒定結果相符，凝膠電泳成像帶譜清晰，同時，與常用方法相比，酶等試驗藥品使用量減少20%～25%，試驗所用時間較常用方法減少了50%以上。[結論]利用優化的SSR分子標記技術體系鑒定雜交水稻種子純度，經濟、快速且鑒定的結果清晰、可靠，同時大大減少瓊脂糖等試驗殘渣的產生，降低了對環境污染，值得推廣、應用。

關鍵詞SSR分子標記；雜交水稻；純度

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）22-07321-02

純度是雜交水稻種子質量的核心指標，是種子質量分級的主要標準，是企業購銷種子的關鍵依據。準確、快速鑒定雜交水稻種子的純度意義重大。然而，過去的田間鑒定需要大量的時間（至少90 d左右），隨著DNA分子標記的興起，利用DNA分子標記鑒定種子純度大大減少了試驗時間，但用常用的PCR擴增程序，做一板樣品（96個樣）仍需要2.5 h左右，凝膠電泳（96個樣）也需要1.5 h以上，并不能完全滿足目前高效的需要。SSR（Simple sequence repeats，簡單序列重復）標記亦稱微衛星（Microsatellite）標記，已被廣泛用于各物種種群劃分、雜種優勢預測和農作物育種等領域[1-6]。隨著農作物雜交種的廣泛推廣，SSR分子標記已被廣泛用于水稻、玉米等雜交種子純度鑒定[7-10]。由于雜交水稻種子的廣泛應用，市場上的品種數目繁多，種子純度鑒定工作量大、鑒定成本較高，筆者擬在常用SSR分子標記技術的基礎上，對試驗耗材用量和PCR等過程進一步優化，以達到節約成本、節省時間的效果，探索一套快速、低耗的SSR分子標記技術鑒定體系，為雜交水稻種子純度鑒定提供快捷、可靠、低投入、少污染的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料重慶三峽農業科學院自制自繁種雜交水稻萬優481及親本萬3A和萬恢481。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取。將雜交水稻萬優481（500粒）、親本萬3A（20粒）和萬恢481（20粒）在光照培養箱內30 ℃下發芽至5 cm左右，然后用CTAB法提取DNA。

1.2.2PCR反應體系、反應程序及電泳方法的優化設計。PCR反應體系：20 ml體系包括dNTP 1.6 ml、PCR buffer2.0 ml、引物2.0 ml、模板DNA2.0 ml、Taq酶0.15 ml、水12.25 ml。

PCR反應程序： 94 ℃預變性5 min；94 ℃15 s，55 ℃15 s，72 ℃15 s，35個循環； 72 ℃ 3 min。

電泳方法優化：36孔子4排（24孔梳子4排），2次點樣檢測288個樣（一次點樣96個樣）。

1.2.3篩選引物。利用親本萬3A、萬恢481的DNA從24對引物中篩選出多態性好的引物P18，供試驗使用。

1.2.4萬優481純度鑒定。利用篩選出來的引物P18對萬優481群體經過PCR、瓊脂糖凝膠電泳、成像，最后讀帶、統計，并計算出該批種子的純度。

2結果與分析

2.1純度鑒定結果用優化的SSR分子標記技術，對500株萬恢481植株苗進行純度鑒定，經讀帶統計，該批種子純度為98.5%，與田間鑒定結果相符。

2.2優化的SSR分子標記技術試驗效果利用優化的SSR分子標記技術進行引物篩選和純度鑒定，最后成像帶譜均較為清晰（圖1），能夠清楚地讀出帶譜，完全可以滿足雜交水稻種子純度鑒定工作。圖1優化后的電泳成像效果2.3PCR耗材及效率分析在試驗耗材方面，優化后的PCR體系較常用體系節省了20%的dNTP、20%的PCR buffer和25%的Taq酶，大幅降低了試驗成本。

在試驗用時上，利用優化后的反應程序擴增一板PCR只需要60 min，而常用反應程序擴增一板PCR則需要150 min左右，即利用優化后的PCR反應程序可以大大減少試驗時間，提高了工作效率。

2.4電泳效率及瓊脂糖利用指數分析傳統的電泳方法，一次制膠只能做96個樣品，用時90 min左右，折合1.07個/min樣品，而優化后，一次制膠可以做出288個樣品，用時130 min，折合2.22個/min樣品，優化后的電泳效率為常用方法2倍多。同時大大減少制膠次數，節省了制膠所用成本。