水曲柳DNA濃度及滴加時間對楊樹花粉管通道法結實率的影響

杜人杰　曲躍軍　金虎　陶雙勇　鄒威　王慶斌　周冬躍　張翼　付靜　時平

摘要[目的]對適宜的水曲柳DNA濃度及滴加時間進行初步探索，獲得具有水曲柳優勢性狀的楊樹植株。[方法]通過花粉管通道法，將攜帶水曲柳基因組的DNA導入楊樹。人工授粉后一定時間在花柱基部進行橫切，把不同濃度DNA溶液滴加到子房切口端，10 d后統計結實率。[結果]在同一時間點，隨著水曲柳DNA濃度的增加，結實率呈現逐漸降低趨勢；隨著授粉與滴加DNA時間的延長，同一濃度下呈現出結實率先降低后升高趨勢。當水曲柳DNA溶液滴加時間控制在人工授粉后6 h左右，DNA濃度為50 μg/ml時是在楊樹上運用花粉管通道法轉化水曲柳基因最適宜的條件，結實率可達17%。[結論] 滴加時間與外源DNA不同梯度水平對轉化結實率有很大影響。

關鍵詞水曲柳；花粉管通道；楊樹；結實率

中圖分類號S792.12文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）22-07323-02

水曲柳材質優良，耐寒性良好，是珍貴的用材樹種。楊樹是營造短輪伐期工業原料速生豐產林和城鄉綠化的主要樹種，楊樹早期速生、無性繁殖容易，可迅速種植形成人工林，解決木材問題，但品種老化及生產力低一直是制約楊樹商品林生產力發展的瓶頸之一，現代轉基因技術為改良楊樹性狀提供了有效途徑。花粉管通道法導入外源DNA的技術，由周光宇等（1983）建立并在長期科學研究中得以發展。花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經過珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞[1]。該方法具有操作簡便經濟、育種時間短等優點，已在植物基因轉化中初見成效，如棉花、水稻、大豆等作物[1]，目前在楊樹應用上只有陳洪偉等（2008）通過花粉管通道導入外源胡楊DNA到白楊中的研究，其他應用尚未見報道。筆者利用花粉管通道法將外源水曲柳DNA導入楊樹，對適宜的水曲柳DNA濃度及滴加時間進行初步探索，為獲得具有水曲柳優勢性狀的楊樹植株，沖破物種之間的界限，實現物種間的基因傳遞，為后續的楊樹良種選育研究提供技術支持。

1材料與方法

1.1材料轉基因受體：黑龍江牡丹江青梅試驗站栽植的22年生中牡1號楊（P.deltoides×P.cathayana）的F1代；供體：牡丹江北山栽植的20年生水曲柳（Fraxinus mandshurica Rupr.）。

1.2方法

1.2.1水曲柳DNA的提取。采用大連寶生物公司《植物基因組DNA純化試劑盒（9768）》提取水曲柳DNA，OD260/OD280為1.8～2.0，水曲柳DNA用去離子水溶解。

1.2.2水曲柳DNA的導入。 采集中牡1號楊的雄枝，實驗室水培，挑選飽滿的花藥，收集花粉，室溫晾干，裝入干燥瓶放入4 ℃冰箱備用。

選擇發育良好、當天初開的中牡1號楊雌花，進行人工授粉，授粉后3～24 h在花柱基部進行橫切。在裝有50～400 μg/ml 水曲柳DNA1 000 μl的離心管中，加入1 μl TWEEN20。用移液器吸取混合后的DNA液在子房切面上進行滴加，滴加10 d后，統計結實率。DNA濃度分別為50、100、200、400 μg/ml，每個處理滴加100個花序；對照DNA濃度為0 μg/ml（已加1 μl TWEEN20），同樣處理100個花序。滴加時間分別為授粉后3、6、12、24 h；每個水平作3次重復。