紫錐菊多糖對LPS損傷后IEC—6細胞分泌IL—1ɑmRNA的影響

關景林

摘 要：為了研究紫錐菊多糖對LPS損傷后IEC-6細胞分泌IL-1α mRNA的影響，以體外培養大鼠小腸上皮細胞為模型，進行細胞分組及收集，并給予LPS刺激造成內毒素損傷，根據GenBank中發布的IL-1ɑ基因序列設計引物，以基因組RNA為模板進行RT-PCR擴增，發現紫錐菊多糖對LPS刺激小腸上皮細胞產生的IL-1α mRNA的表達減少。

關鍵字：紫錐菊；IL-1；PCR；IEC-6

紫錐菊（Echinacea purpurea）藥用歷史可追溯到北美印第安人時期，該屬植物被印第安人作為治療外傷、蛇咬、頭痛及感冒的最佳藥物[1]。在北美和歐洲紫錐菊也曾作為傳統抗感染、抗炎藥物使用。紫錐菊的多糖部分及異丁酰胺部分有免疫調節的功能，可阻止病原體引起的炎癥，有較強的抗炎活性 [2～5]。在我國，紫錐菊于上世紀70 年代開始引入。 由于引種時間短，相關研究較少，但已引起廣泛關注。目前，北京、天津、湖南、陜西、廣西、四川等省市都有廠家生產紫錐菊根乙醇提取物[6]。本研究對紫錐菊根乙醇提取物的抗炎作用進行初步探討。

紫錐菊主要是通過激活不同的免疫細胞來提高人體自身免疫，促進干擾素和抗體的產生[7]，而增強機體對細菌和病毒感染的抵抗力，能夠刺激單核淋巴細胞的增殖和巨噬細胞的活性，使巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子-a（TNF-a）、白細胞介素（IL-1、IL-6）和干擾素B2，可誘導抵抗不同的DNA和RNA病毒的感染，用來治療和預防各種疾病。紫錐菊含有多種化學成分，包括多糖（polysaccharides）、多種烷基酰胺類化合物（alkylam·ides）、咖啡酸類衍生物（caffoylphenos）、黃酮類、揮發油，等等[8]。在藥理方面研究較多的是多糖，對提高機體免疫力，抗病毒，治療流感，抗菌，消炎，抗感染有顯著效果[9]，主要用于治療感冒、咳嗽、支氣管炎和上呼吸道感染及其它因素引起的感染。因此，本文擬對紫錐菊多糖對LPS損傷后IEC-6分泌IL-1α mRNA的影響進行研究。為研究紫錐菊多糖的抗炎、抗感染的作用機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗試劑

核酸染料Gold view：東盛生物有限公司

逆轉錄試劑盒：美國GeneCopoeia公司

Trizon：康為世紀

2×Taq MasterMix：康為世紀

DL2000DNA Marker （100-2，000）：Takara公司

1.2主要儀器

臺式高速離心機（Anke TGL-16G）；FA20048電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；SZ-93A自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；BIO-BEST200E凝膠成像儀（JYOZG JUNYI 北京尹意東方電泳設備有限公司）；EDC-810型基因擴增儀（東盛創新生物科技有限公司）。

1.3實驗方法

1.3.1 細胞培養

IEC-6細胞從正常大鼠小腸隱窩細胞分離出來并經體外培養傳代而建立起來的細胞株，保持了小腸上皮干細胞未分化的特性，在組織學或免疫學方面與隱窩細胞無明顯差別。對凍存的IEC-6細胞進行復蘇。將細胞凍存管置于37℃水浴中，使凍存管中的凍存物在1 min內融化。細胞解凍后，迅速從水浴中取出，用70%酒精消毒凍存管，并迅速轉入無菌操作臺。打開凍存管，將凍存管中的細胞轉入含培養液的培養瓶中；培養液為含10%胎牛血清的DMEM培養基，配以0.01 mg/mL胰島素，在CO2培養箱（5%CO2）中培養。次日換液，至80%融合時，0.25%胰酶消化傳代，5 d傳代一次，傳代5次后的細胞用于實驗分組。

1.3.2細胞分組

將培養的細胞分為6組 對照組：以GAPDH為對照； LPS組：濃度為10 ug/mL； APS50 μg/mL+LPS組；APS100 μg/mL+LPS組；APS200 μg/mL+LPS組；APS500 μg/mL+LPS組。

1.3.3細胞收集

IEC-6細胞在DMEM培養基中加入不同濃度的紫錐菊多糖（50 μg/mL；100 μg/mL；200 μg/mL；500 μg/mL）培育24 h，給予LPS（10 μg/mL）刺激1 h后，收集細胞，分別給LPS（10 μg/mL）刺激1 h和4 h后，收集細胞，備用。

1.3.4細胞總RNA提取

吸取單層細胞培養液，加入適量TRIzon，每10 cm2面積需要1 mLTRIzon，反復吹打使細胞裂解，如果TRIzon量不足可能導致RNA中有DNA污染；樣品中加入TRIzon后反復吹打幾次，使樣本充分裂解，冰上放置5 min，使蛋白核酸復合物完全分離；向以上溶液中加入氯仿（每使用1 mLTRIzon加入0.2 mL氯仿），蓋好管蓋，劇烈震蕩15 s，冰上放置2～3 min；4 ℃ 12000 rpm離心15min，此時樣品分成三層：紅色有機相，中間層和上層無色水相，RNA主要在水相中，把水相（約600 μL）轉移到一個新的RNase-Free離心管（自備）中；在得到的水相溶液中加入等體積乙丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min。4 ℃ 12000 rpm離心10 min，棄上清；75% 乙醇（用無RNase的水配制）洗滌沉淀，每使用1mL TRIzon 用1 mL 75%乙醇對沉淀進行洗滌。4 ℃ 12000 rpm離心3 min，小心吸取上清，注意不要吸取沉淀；室溫放置2～3 min，晾干，加入50 μL無RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃。

1.3.5 逆轉錄反應

2.3.8 瓊脂凝膠電泳

1%瓊脂糖凝膠電泳：1% 瓊脂糖+0.5×TAE至體積50 mL，（以DL2000為DNA Marker）每孔加樣5 μL，以DL2000為DNA Marker 加樣3 μL，120V電泳30 min左右，在凝膠成像系統下觀察結果。

2結果與分析

2.1紫錐菊多糖抑制了LPS刺激IEC-6細胞分泌IL-1ɑ mRNA產物的表達

RT-PCR分析方法檢測顯示，當LPS刺激IEC-6細胞時，IL-1α mRNA被誘導分泌具有顯著意義的增加。而紫錐菊可以抑制這種作用，并且具有劑量依賴性，50 μg/mL紫錐菊可以部分抑制LPS刺激IEC-6產生的IL-1α mRNA水平，而200 μg/mL及500 μg/mL紫錐菊隨著濃度的增加，其抑制IL-1α mRNA的水平逐漸增加，如圖1。

2.2紫錐菊多糖具有時間依賴性的抑制LPS刺激IEC-6細胞產生IL-1ɑ mRNA水平的表達

本文采用了將IEC-6細胞用500 μg/mL紫錐菊預處理24h，然后用LPS（10 ug/mL）刺激達1 h及4 h，采用RT-PCR方法進行IL-1α mRNA分析，LPS誘導IL-1α mRNA表達被紫錐菊有效的抑制，如圖1。

3討論

IEC-6是從正常大鼠小腸隱窩細胞分離出來并經體外培養傳代而建立起來的細胞株，在合適條件下分化為成熟的腸上皮細胞。腸上皮細胞是腸道黏膜屏障的重要組成部分，同時被認為在宿主表面的天然及獲得性系統免疫中起中心調節作用，是宿主與病原微生物雙向聯系的第一道防御。一些腸道疾病和非腸道疾病均可引發腸功能障礙，各種應激狀態時，全身免疫功能下降，腸道內細菌和內毒素LPS侵入體循環和腸組織內，造成細菌移位和腸源性內毒血癥，從而進一步加劇腸上皮細胞的損傷，激活細胞內一系列的免疫反應，導致一些炎癥介質如IL-1等的產生和釋放，引起全身炎癥反應[10]。在LPS作用下，腸道上皮細胞NF-κB可被激活，高效誘導多種細胞因子（IL-1α），黏附因子，趨化因子和急性期反應蛋白的基因表達增加[11]。

國內路景濤[12]研究證實黃芪多糖能夠抑制細菌脂多糖誘導大鼠腹腔巨噬細胞釋放的白細胞介素的分泌，說明黃芪可以通過抑制炎癥因子的分泌從而減少組織細胞的損傷來發揮其對機體的免疫保護作用。研究證實，紫錐菊對正常IEC-6細胞具有促進細胞增殖作用，當LPS刺激IEC-6時，IL-1α的表達增加，當細胞受到LPS損傷時，紫錐菊卻不能呈現出顯著的促增殖作用，提示紫錐菊的促細胞的增值作用有賴于細胞處于正常的生理狀態。紫錐菊能夠抑制細菌脂多糖誘導IEC-6細胞釋放IL-1α的分泌，可以抑制炎癥因子的分泌，并且紫錐菊對這種因子的抑制作用具有時間依賴性和濃度依賴性，從而減少組織細胞的損傷來發揮其對機體的免疫保護作用。

4結論

4.1 LPS作用于小腸上皮細胞后，其分泌的細胞因子IL-1α mRNA產生增多，而紫錐菊多糖可以抑制LPS刺激細胞分泌的IL-1α mRNA的產生，從而起到腸道黏膜的保護作用。這種抑制作用具有濃度及時間依賴性。

4.2 紫錐菊多糖對小腸上皮細胞的免疫保護作用可能是通過抑制細胞因子IL-1α過量表達，從而減少其對組織細胞的炎性損傷。

（編輯：何芳）

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