甘蔗幾丁質酶基因ScChiⅦ1的克隆與表達分析

王珊珊 蘇亞春 楊玉婷 郭晉隆 許莉萍

摘 要 以甘蔗（Saccharum spp. hybrid）抗黑穗病基因型崖城05-179為材料，采用同源克隆法獲得了1個幾丁質酶基因全長cDNA序列（GenBank登錄號為KF279661），命名為ScChiⅦ1，序列長907 bp，編碼299個氨基酸，屬于糖苷水解酶第19家族，預測為胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。聚類分析顯示，該基因與其他植物ClassⅦ幾丁質酶基因聚為一類。基因組序列（GenBank登錄號為KF279662）分析顯示，該基因含有2個長度分別為615 bp和86 bp的內含子。實時熒光定量分析結果表明，甘蔗黑穗病菌脅迫下，ScChiⅦ1在抗病（崖城05-179）和感病基因型（柳城03-182）中差異表達，推測ScChiⅦ1可能參與黑穗病菌脅迫的防御反應。組織特異性表達分析結果顯示，ScChiⅦ1在甘蔗葉、芽、皮、肉、根中均有表達，但在芽中表達量最高，推測與該病原從蔗芽侵入有關。研究結果為進一步研究甘蔗幾丁質酶基因功能及甘蔗與黑穗病菌互作機制提供了有益的信息。

關鍵詞 甘蔗；幾丁質酶；克隆；生物信息學分析；黑穗病菌；定量表達

中圖分類號 S566.1；Q943.2 文獻標識碼 A

甘蔗是最主要的糖料作物，全世界食糖產量的78%來自甘蔗[1]。病害是影響甘蔗產量和糖分的重要生物逆境，而真菌性病害是甘蔗生產上最重要的病害，其中甘蔗黑穗病（Sporisorium scitamineum）是我國蔗區最嚴重的病害之一，大量病原分生孢子由氣體傳播導致甘蔗黑穗病的再侵染和病害流行[2]。主栽品種新臺糖22號對黑穗病抗性差是導致我國黑穗病流行的主要原因，也是該品種宿根產量明顯下降的主要的原因[2]。公認提高甘蔗品種抗病性是最經濟有效的病害控制策略。長期以來，甘蔗主要依靠雜交育種來提高栽培品種的抗病性，但是，對遺傳背景為異源多倍體、非整倍體、基因組龐大、染色體達120條左右的甘蔗（栽培品種）而言，培育高產、高糖、抗病聚合基因型難度大。不僅需要龐大的雜交分離群體，且需要經過10 年或更長時間的產量潛力、穩定性和適應性的鑒定與評價，一般育成優良品種的概率極低，僅為1/250 000[3]。基于以上，發掘功能基因或逆境應答基因，以作為后續轉基因改良的目的基因或進一步開發標記輔助選擇與評價技術的基礎，對甘蔗聚合育種而言無疑是重要的。

幾丁質酶（EC.3.2.1.14）是一種糖苷水解酶。該酶通過催化降解病原真菌細胞壁的主要成分幾丁質，從而抑制真菌的生長與繁殖[4]。正常情況下，植物體內幾丁質酶的含量很低，但當植物受到外源脅迫因子如病原細菌、真菌或病毒侵染后，其表達量迅速提高，van-kan J A 等[5]在研究番茄與真菌性病原葉霉病菌（Cladosporium fulvum）的互作時，就發現了該現象。Broglie等[6]最早通過分子雜交的方法，從菜豆（Phaseolus vulgaris）的cDNA中分離到幾丁質酶基因，并將其轉化到煙草（Nicotiana tabacum）中，結果顯示轉化后的植株對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的抗性高于對照組，這是植物幾丁質酶基因克隆與功能鑒定的首例報道。目前，已從水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、菜豆等近100種植物中，克隆到了幾丁質酶基因，這些基因分別屬于幾丁質酶家族的不同類型[7-8]。近年來，利用外源幾丁質酶基因導入植物以增強抗病性的成功事例較多。番茄（Solanum lycopersicum）、小麥（Triticum aestivum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）和香蕉（Musa paradisiaca）等多種植物已獲得了轉幾丁質酶基因的植株[9-12]。顧麗紅等[13]將帶有修飾過的煙草Ⅰ類幾丁質酶基因和Ⅰ類β-1， 3-葡聚糖酶基因的雙價植物表達載體，利用農桿菌介導方法，轉化甘蔗品種“ROC”10和“ROC”22，轉基因后代對甘蔗黑穗病的抗性得到不同程度的提高。但迄今，從GenBank檢索到的甘蔗幾丁質酶核酸序列有4個，相關EST 也僅有3條，有關甘蔗幾丁質酶抗病研究僅有2例報道，都是涉及甘蔗與甘蔗梢腐病原菌（Colletotrichum falcatum或Gibberella fujikuroi）的生物互作系統，其中Sheng Lin等[14]用真菌病原菌Gibberella fujikuroi接種果蔗，對接種0 h和48 h以后的葉片從蛋白質組學、生理學、生物化學和實時熒光定量PCR進行研究，并發現幾丁質酶在48 h時表達量最大，作者認為果蔗幾丁質酶對Gibberella fujikuroi有一定抗性；Rahul等[15]從接種甘蔗梢腐病原菌后的抗病（Co 93009）和感病（CoC 671）品種分離得到了2個幾丁質酶基因，實時熒光定量結果顯示，幾丁質酶基因在抗病品種的表達水平較高。

本研究借助同源克隆方法，從甘蔗中分離獲得幾丁質酶基因的全長cDNA和基因組序列。而后，應用生物信息學軟件，對基因所編碼的蛋白結構和功能進行預測分析。同時，借助實時熒光定量PCR技術，初步研究了該基因的組織表達情況及其在黑穗病菌脅迫下的表達模式。為進一步研究甘蔗幾丁質酶基因在抗病育種中的作用，提供一定的基礎信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗基因型（Saccharum spp. hybrid）崖城05-179和柳城03-182來自國家甘蔗產業技術研發中心的甘蔗資源工作圃，供試的甘蔗黑穗病菌采自柳城03-182。實驗取崖城05-179和柳城03-182生長健壯、長勢一致的蔗莖，砍成雙芽段后，采用前人[16]類似方法進行催芽培養，即在清水浸泡24 h，然后置于程控光照培養箱中，采用光照12 h和黑暗12 h交替的方式培養，相對濕度65%，溫度為32 ℃。待蔗芽長至2 cm后，以5×106 個/mL甘蔗黑穗病菌孢子懸浮液針刺接種蔗芽后，在28 ℃下培養，其他條件不變。同時，對照處理以注射無菌水代替黑穗病菌，方法參照文獻[17]，分別于接種后的第0、6、12、24和48 h，各取5個單芽，迅速用液氮固定，-80 ℃冰箱保存備用。對于甘蔗不同組織部位材料的采集，從田間隨機選取5株新植的成熟期甘蔗，表觀健康、長勢一致的崖城05-179，清水洗凈根部泥土，收集白色嫩根，并從地上部位的完整蔗節算起，截取第七和第八節蔗莖節間的蔗芽、蔗皮和蔗髓，以及甘蔗+1葉，所有材料立即放入液氮速凍，再放置在-80 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 主要試劑 pMD18-T載體、TAKALA Ex Taq和Prime Script RT-PCR Kit購自TaKaRa公司；E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I質粒提取試劑盒、DNA快速純化/回收試劑盒購自OMEGA生物科技公司；TrizolR Reagent試劑購自Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑購自Roche公司；Marker、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 按TrizolR Reagent說明書，分別提取崖城05-179和柳城03-182接種黑穗病菌后第0、6、12、24和48小時的蔗芽總RNA。取1.0 μL RNA樣品，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。參照Prime Script RT-PCR Kit操作說明書，將RNA反轉錄合成cDNA第1鏈，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，并用紫外分光光度計測定cDNA濃度，最后將各處理cDNA濃度稀釋至同一濃度。

1.2.2 基因組DNA提取 參照姚偉等[18]的方法，采用CTAB法提取崖城05-179蔗芽基因組DNA，1.0%電泳檢測DNA質量后，經紫外分光光度計檢測濃度，-20 ℃保存備用。

1.2.3 引物的設計 根據同源克隆方法，搜索同源物種高粱基因組數據庫中推定的幾丁質酶基因序列（GenBank登錄號為XM_002445832），應用Primer Premier 5.0軟件設計特異引物，上游引物ScChiⅦ1F：5′-ATGTCCGGGACGCGA-3′，下游引物ScChiⅦ1R：5′-CATATTCTTAGAAGTCAGAACTCT-3′，引物送上海捷瑞生物有限公司合成。

1.2.4 PCR擴增 分別以崖城05-179接種黑穗病菌48 h的反轉錄產物和崖城05-179蔗芽基因組DNA為模板，以ScChiⅦ1F和ScChiⅦ1R為引物進行目的片段擴增。PCR反應體系參照TAKALA Ex Taq說明書，PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min；35個循環PCR擴增（94 ℃，30 s； 60 ℃，45 s；72 ℃，1 min）；72 ℃，再延伸10 min。PCR產物回收后與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選和菌液PCR驗證后，再送上海生物工程技術有限公司測序。

1.2.5 甘蔗幾丁質酶基因生物信息學分析 利用在線軟件SignalP4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行幾丁質酶基因蛋白質信號肽分析；借助Scanprosite（http：//www.expasy.ch/tools/scanprosite/）軟件，分析蛋白質的序列結構和家族歸類；利用Psort（http：//psort.hgc.jp/form.html）程序，進行蛋白的亞細胞定位預測；利用NPS@網站（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）和SWISS-MODEL生物軟件，分別進行蛋白質二級結構和三級結構預測；利用Blast在線軟件，將測序結果與其他植物幾丁質酶基因的核酸和氨基酸序列進行比對分析；聚類分析中涉及的擬南芥和水稻幾丁質酶基因的氨基酸序列從GenBank中獲得，并借助Vector NTI軟件構建系統進化樹。

1.2.6 基因表達分析 根據克隆獲得的甘蔗幾丁質酶基因的ORF序列，設計特異性實時熒光定量PCR引物，上游引物ScChiⅦ1QF：5′-TACAACCA

CGAATTGAGCCR-3′，下游引物ScChiⅦ1QR：5′-TAGCACCAAAGCCAGGATA-3′。以GAPDH基因（上游引物：5′-CACGGCCACTGGAAGCA-3′和下游引物：5′-TCCTCAGGGTTCCTGATGCC-3'）作為內參基因[19-21]。定量反應體系按照SYBR Green說明書，定量PCR擴增在7 500型實時熒光定量PCR儀（ABI，USA）上完成。每個樣品設置3次重復。擴增程序如下：50 ℃，2 min；40個循環PCR擴增（95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min）。反應結束后，進行融解曲線分析。采用2-△△CT算法分析基因表達水平[20]。

2 結果與分析

2.1 甘蔗幾丁質酶基因的克隆鑒定

根據特異性引物進行cDNA的PCR擴增，產物進行電泳檢測，結果見圖1-a，顯示在900～1 000 bp間有明顯的擴增帶，與預期目標片段產物條帶大小相符。將該片段回收純化后，選擇經藍白斑篩選和菌液PCR檢測鑒定為陽性的克隆，進行測序。測序結果在GenBank數據庫進行比對分析，發現其與其他植物幾丁質酶基因具有很高的相似性，初步推斷該序列為甘蔗幾丁質酶基因，命名為ScChiⅦ1，GenBank登錄號為KF279661。其基因組序列擴增的PCR產物電泳檢測結果見圖1-b，測序顯示獲得一條長1 608 bp的核酸序列，GenBank登錄號為KF279662。

2.2 ScChiⅦ1基因生物信息學分析

2.2.1 ScChiⅦ1基因核酸序列和氨基酸序列分析 對ScChiⅦ1基因進行核酸序列分析，結果顯示（圖2），該基因cDNA全長907 bp，包含1個900 bp的完整開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，共編碼299個氨基酸。基因組克隆分析顯示其含有2個內含子，分別為615 bp和86 bp，且均符合“GT-AG”內含子法則。ScChiⅦ1基因推導的編碼蛋白，帶正電的氨基酸（D、E）29個，帶負電的氨基酸（R、K）33個。采用在線軟件ExPASy中的ProtParam，預測推導蛋白的相對分子質量為33.06 ku，理論等電點為6.08，表明該蛋白是一種酸性蛋白。

2.2.2 ScChiⅦ1基因編碼蛋白的二級結構分析 ScChiⅦ1編碼蛋白二級結構分析顯示該蛋白無規則卷曲所占比例最高（54.85%），其次是α螺旋結構（25.08%），延伸鏈和β折疊分別占13.38%和6.69%。

2.2.3 ScChiⅦ1編碼蛋白的三級結構分析 以3w3eB（1.50 A）為參考模型，對ScChiⅦ1編碼蛋白進行建模分析，結果如圖3，可知ScChiⅦ1蛋白的空間結構主要由α螺旋和無規則卷曲構成，這與蛋白質二級結構的預測結果相吻合。將ScChiⅦ1空間構象模擬圖與水稻（NP_001062281.1）、小麥（EMS53119.1）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon XP_003572384.1）的模擬圖進行比較，發現螺旋等空間結構特點基本相同。

2.2.4 ScChiⅦ1編碼蛋白的亞細胞定位 Psort軟件分析顯示ScChiⅦ1基因編碼蛋白分泌到胞外的概率為67.6%，存在微體或過氧化物體中的概率為23.0%，存在于溶酶體中的概率為19.0%，推測其為分泌蛋白。

2.2.5 ScChiⅦ1編碼蛋白的信號肽預測 借助SignalP4.1 Server在線軟件，預測ScChiⅦ1蛋白的信號肽（圖4），顯示在該蛋白氨基酸序列的第22～23位氨基酸上，有1個潛在的信號肽斷裂位點，概率為92.9%，同時，C（原始剪切位點的分值）最大值、Y（綜合剪切位點的分值）最高峰和S（信號肽的分值）最大值位于同一個區域，因此，推測ScChiⅦ1蛋白具有信號肽，其信號肽序列為MSGTRGAALLLLLLVTSAAAGG，從第23個氨基酸開始則為成熟蛋白質。

2.2.6 ScChiⅦ1編碼蛋白的結構域及功能預測 經Blast比對分析發現ScChiⅦ1蛋白序列存在保守結構域（圖5），從第110位-154位氨基酸區域是幾丁質酶典型的催化域，屬于糖苷水解酶第19家族。同時，ScChiⅦ1編碼蛋白具有與溶菌酶超家族基因相似的保守結構域，因此，推測該基因兼具溶菌酶活性。

2.2.7 ScChiⅦ1同源性分析及系統進化樹構建 植物幾丁質酶基因是家族基因，將本研究中克隆到的ScChiⅦ1基因與水稻（O. sativa NP_001062281.1）、小麥（T. aestivum EMS53119.1）、二穗短柄草（B. distachyon XP_003572384.1）、 綠蘿（Epipremnum au

reum BAI63079.1）、油棕（Elaeis guineensis AFV302

04.1）、 山羊草（Aegilops tauschii EMT31181.1）等的幾丁質酶基因進行同源性比對，其氨基酸的同源性分別為86%、85%、82%、73%、71%和70%（圖6）。借助Vector NTI軟件，將ScChiⅦ1編碼蛋白與在TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）數據庫中搜索到的23個擬南芥幾丁質酶基因及從NCBI中下載的25個已知的其他植物幾丁質酶的氨基酸列[22]，構建了N-J系統進化樹（圖7）。聚類結果顯示ClusterⅢ和ClusterⅤ聚為了一支， ScChiⅦ1被聚類在幾丁質酶ClassⅦ。本研究中克隆到的ScChiⅦ1基因編碼蛋白的N-端含有一個22個氨基酸的信號肽，具有催化結構域，但不含有幾丁質結合區（Chitin-binding domain， CBD），缺少半胱氨酸和脯氨酸的可變交聯區，這與前人[23]有關 ClassⅦ幾丁質酶的研究結果一致。

2.3 甘蔗黑穗病菌脅迫下ScChiⅦ1基因的表達模式

病原菌侵染植物后，幾丁質酶基因轉錄水平的變化可以反映出該基因參與抗病反應的時間早晚以及可能參與的防御反應機制[24]。本研究利用實時熒光定量PCR技術，獲得了2個甘蔗基因型崖城05-179（抗病）和柳城03-182（感病）在黑穗病菌侵染0、6、12、24和48 h時間點ScChiⅦ1基因相對表達量的變化情況。從圖8中可以看出，ScChiⅦ1基因在不同基因型中差異表達，對于抗病基因型，總體呈現“先小幅下調后上調”的趨勢，在48 h時間點，該基因表達量開始上調；對于感病基因型，總體呈現“先大幅度下調，后上調，再小幅下調”的趨勢，在6 h時間點，該基因表達量最小，最高值則出現在接種后的24 h。總體上，ScChiⅦ1基因只是小幅應答甘蔗黑穗病菌侵染的脅迫。

2.4 ScChiⅦ1基因在甘蔗不同組織中的表達特性

以GAPDH基因為內參基因，應用實時熒光定量PCR技術，獲得了ScChiⅦ1基因在甘蔗葉、芽、皮、髓和根中的相對表達量（圖9），顯示ScChiⅦ1在甘蔗上述組織中均有表達，但在芽中的表達量相對較高，約為蔗莖髓部組織中表達量的2倍，其次為葉和皮，分別為髓中表達量的1.67和1.48倍。

3 討論與結論

當植物受到真菌侵染時，會誘發自身防御機制產生病程相關蛋白，幾丁質酶作為一類重要的病程相關蛋白（Pathogenesis-related protein，PR），已被從多種植物中克隆獲得并將其作為外源基因導入植物以增強其抗病性[6-13]。植物幾丁質酶的分類已修改多次[4]，目前的分類主要有2種，一種是把其分為6類，如許鳳華等人借助4個生物學軟件（SignalP3.0、TMHMM2.0、TargetP1.1和big-PiPredictor）將水稻的37個和擬南芥的24個幾丁質酶基因聚為6類[22]；另一種是根據幾丁質酶的結構特點，把其分為7類[24]，其中第1個ClassⅦ幾丁質酶基因是從陸地棉中克隆的，該基因與ClassⅠ、ClassⅡ同源性僅為30 %，N-端具有信號肽，但不含有CBD，同時缺少半胱氨酸和脯氨酸的可變交聯區[23]。值得注意的是：在本研究獲得的N-J系統進化樹中，原歸入ClusterⅠ的幾丁質酶基因AAB23692聚在ClusterⅣ，而擬南芥的2個幾丁質酶基因（GenBank登錄號為At1g05850和At3g16920）聚在ClusterⅦ，另2個基因（GenBank登錄號為At1g 02360.1和At4g 01700.1）聚在ClusterⅠ，這與許鳳華等[22]的研究結論不相符，可能是由于聚類過程中所使用的分析軟件不同所引起的。

編碼蛋白的結構域及功能預測顯示，ScChiⅦ1蛋白屬于糖苷水解酶第19家族（圖5），這與植物幾丁質酶分類中只有ClusterⅢ和ClusterⅤ屬于糖苷水解酶第18家族，其余類型屬于糖苷水解酶第19家族的結果也是一致的[25-27]。對于植物的ClassⅦ幾丁質酶基因，在該基因的生物學活性研究方面，僅見Singh等[28]將從小麥中分離到1個ClassⅦ幾丁質酶基因在E. coli BL21菌株中實現過表達，所獲得的純化重組蛋白在離體培養的抑菌實驗中，表現出了對甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、茶葉斑病菌（Pestalotia theae）、水稻鞘腐病菌（Sarocladium oryzae）、黑麥病菌（Fusarium sp.）和水稻粒變色病菌（Alternaria sp.）具有廣譜的抗性。此外，信號肽對于控制蛋白質的分泌路徑和指導蛋白質的定位有重要作用，一般位于分泌蛋白的N-端，由20多個氨基酸組成[3]，這與本研究對所獲得的ScChiⅦ1基因的信號肽預測結果（22個氨基酸）是一致的。

前人[29]研究認為，多數病原菌侵染植物是從細胞間隙開始的，病原菌侵入后，阻礙或破壞了植物組織攝取營養，影響了植物正常生長，因此，抗真菌蛋白最好在胞間表達更為有利抵御病原菌的侵染。本研究所克隆的ScChiⅦ1基因通過亞細胞定位，預測其分泌到胞外的概率較大（67.6%），推斷該基因如在甘蔗中超表達，其所表達的蛋白可能有助于直接參與對甘蔗黑穗病菌的防御作用。

幾丁質酶基因是一種重要的PR基因，在植物受到病原侵染時，其表達量顯著增加。油菜（Brassica campestris）受到病原菌Phoma lingam侵染24 h后，抗病品種中Ⅳ型幾丁質酶基因的表達量是感病品種的3倍[30]。楊郁文等[30]報道了棉花（Gossypium hirsutum）受到枯萎和黃萎病原菌侵染后，棉花中Ⅲ型和Ⅳ型兩類幾丁質酶基因在抗、感品種中的表達存在明顯差異，其中Ⅳ型僅在抗病品種中呈現表達上調，而Ⅲ型還在棉花感病品種中受黃萎病菌誘導表達。本研究中，黑穗病菌侵染甘蔗后，ScChiⅦ1基因在抗感基因型中的表達模式也存在差異，抗病品種中呈現“抑-揚”的表達模式，而在感病品種中則表現為“抑-揚-抑”的表達模式。該研究結果與前人在棉花-枯黃萎病菌生物系統中的研究結果有一定的相似性和差異[30]，但與前人[31]研究幾丁質酶在抗病品種中的表達量明顯高于感病品種的表達量的結論是不大一致的，推測可能是由于不同的植物-病原生物互作系統和所研究的幾丁質酶基因類型不同所導致的。根據報道，病原菌誘導植物中幾丁質酶的表達可能存在不同的機理，如Salzer等[32]在苜蓿菌根形成過程中，發現Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型幾丁質酶基因受病原菌誘導表達的時期不同，Ⅰ型和Ⅱ型幾丁質酶基因是在成瘤的早期被誘導，而Ⅳ型則是在瘤成熟階段才被誘導。ScChiⅦ1基因的組織表達特異性分析表明，該基因在甘蔗不同器官（芽、 葉、 髓、 皮、 根）中均有表達，但在芽中的表達量最高，而前人[2]的研究顯示黑穗病菌侵染甘蔗的部位是蔗芽而非甘蔗葉片、蔗莖或根部，因此，推測ScChiⅦ1基因在蔗芽中的轉錄本積累可能起到參與防御黑穗病菌侵染的作用。

綜上所述，本研究采用同源克隆法，獲得了1個ClassⅦ甘蔗幾丁質酶基因ScChiⅦ1（GenBank登錄號為KF279661）。該基因與已知的小麥、水稻等植物幾丁質酶基因具有較高的同源性，定量分析顯示該基因參與了甘蔗黑穗病菌脅迫應答，并在抗、感病性基因型中呈差異應答模式，且在芽中表達量最高，考慮到該病原菌是從蔗芽侵入，推測該基因在抵御病原侵入以及侵入后的生物防御中起作用有關，但是具體功能及其作用機制仍需要進一步的功能驗證。

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