桐花樹內生細菌動態及拮抗植物病原菌菌株篩選鑒定

盧乃會 嚴玉寧 何紅 黃勤知

摘 要 以熒光顯微計數法和平板分離法分別對桐花樹根莖葉內生細菌總量和可培養細菌數量進行周年動態初步測定，并對拮抗植物病原菌的可培養細菌菌株進行篩選鑒定。結果表明：桐花樹根莖葉內均含有大量的內生細菌，其中根部內生細菌總量為0.88×107～49.67×107 ind./g FW，7月份最大，葉部細菌總量為1.07×107～65.07×107 ind./g FW，也以7月份最大，莖部細菌總量為1.1×107～19.73×107 ind./g FW，以5月份最大；而根莖葉可培養細菌含量分別為1.02×103～13.18×103、0.13×103～11.24×103、0.31×103～10.36×103 CFU/g FW，均以3月份數量最大，周年不同月份之間細菌總量和可培養細菌數量均差異顯著。用平板對峙生長法，從86株可培養內生細菌中篩選獲得1株對香蕉葉鞘腐敗病菌、香蕉枯萎病菌、馬拉巴栗莖腐病等植物病原菌均有較強拮抗作用的Aec23菌株，經形態、生理生化測試及16S rDNA序列比較分析，Aec23菌株初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

關鍵詞 桐花樹；內生細菌；時空動態；植物病原菌；拮抗細菌

中圖分類號 S476 文獻標識碼 A

紅樹林由于生長于海岸潮間帶的特殊生境，導致其共附（內）生微生物類群的復雜性和獨特性[1-3]，因此有關紅樹林微生物的研究近年來已越來越多，成為研究的熱點之一。國內外學者Ravikumar[4]、Hong[5]等分別對紅樹林放線菌種群多樣性和相關活性物質進行了研究報道，鄧祖軍[6]、Peng[7]等對紅樹內生真菌種群多樣性及其活性物質進行了研究，并從中獲得功能特殊、結構新穎的抗菌活性物質。但有關紅樹內生細菌周年數量時空動態變化，目前尚未見報道。本實驗室近年來對紅樹內生細菌及其在生防植物病害中的作用開展了一系列研究，不僅獲得了多株對不同植物病原具有良好防病效果的內生細菌菌株及其抗菌活性物質，同時也證明了紅樹內生細菌是植物病害生物防治不可多得的資源菌來源。為此，筆者以廣東湛江灣分布廣、面積大的桐花樹為研究對象，在調查其內生細菌周年時空變化動態的同時，以香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）、香蕉葉鞘腐敗病菌（Pantoea agglomerans）、馬拉巴栗莖腐病菌（Phytophthora palmivora）和芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等為供試病原菌，從桐花樹可培養內生細菌中篩選對植物病原真菌、細菌和卵菌均有拮抗作用的菌株，并對其進行了鑒定。為紅樹內生細菌資源調查研究以及廣譜型植物病害生防菌株的篩選利用等提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 紅樹植物桐花樹（Aegiceras corniculatum），于2010年1～11月（奇數月份）采自廣東湛江紅樹林自然保護區（21°20′N～21°25′N，109°50′E～109°53′E），編號封存帶回實驗室進行內生細菌分離。

1.1.2 供試培養基 海水NA培養基用于內生細菌平板計數測定（蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，瓊脂20.0 g，過濾海水1 000 mL，pH7.2～7.4）；LB培養基用于拮抗菌株基因組DNA的提取（胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4）；PDA培養基用于菌株拮抗效果測定（馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20.0 g）；NB培養基用于菌株發酵（蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4）。

1.1.3 供試病原菌菌株 香蕉葉鞘腐敗病原菌（Pantoea agglomerans）[8]；芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）；香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）；馬拉巴栗疫霉病菌（Phytophthora palmivora）[9]，均為本實驗室分離鑒定和保存。

1.2 方法

1.2.1 桐花樹可培養內生細菌數量測定 樣品用自來水沖洗干凈，晾干后分別稱取根、莖、成熟葉片各5.0 g，75%酒精表面消毒30 s后，再用0.1%升汞表面消毒（對應40 s、1 min、2 min），用無菌海水沖洗3次，陰干后加20 mL無菌海水于滅菌研缽中剪碎研磨，浸泡15 min后，吸取樣品浸泡液100 μL涂布于海水NA培養基平板上，25 ℃黑暗培養箱中培養，4～7 d后觀察計數，每樣品3次重復。根據菌落形態、顏色等挑取單菌落，純化保存備用。

1.2.2 桐花樹內生細菌總數測定 參考趙海萍[10]等海洋細菌熒光顯微計數法（略有改進）：取1.2.1中浸泡液，加入40%甲醛溶液（終濃度1%）固定，吸取100 μL固定液至帶有黑色微孔濾膜的抽濾裝置管中，并滴加1～2滴吖啶橙（終濃度為0.1%）染色3 min，真空抽濾。將濾膜置于載玻片上，Olympus BH22熒光顯微鏡下100倍觀察，計算樣品內生細菌總數。計算公式為：E=（×S1×V0）/（m×S2×V1）。其中：E：樣品中的細菌含量（個/g）；：計數視野細菌數量的平均值（個）；S1：濾膜面積（mm2）；S2：顯微鏡的視野面積（mm2）；V0：浸泡樣液體積，即20 mL；V1：過濾樣液體積，即0.1 mL；m：植物樣品質量g。

1.2.3 拮抗菌株的篩選 病原細菌拮抗菌株篩選參照陳振明[11]等的方法稍加改進：取NB、37 ℃、150 r/min振蕩培養24 h的香蕉葉鞘腐敗病菌于NA培養基上制成含菌平板，然后接種1.2.1中活化的細菌菌株，于28 ℃下黑暗培養24～48 h，觀測其抑菌圈大小，每處理重復3次。

病原真菌拮抗菌株篩選采用對峙生長法，在PDA平板中央接種供試病原菌菌塊，離平板邊緣1.5 cm處對角線接種1.2.1中活化的細菌菌株，28 ℃下黑暗培養72～96 h，觀測其抑菌圈大小，每處理重復3次。

1.2.4 拮抗菌株形態學觀察和生理生化試驗 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[12]和《植病研究方法》[13]進行。

1.2.5 菌株16S rDNA序列分析 取LB培養基，37 ℃、120 r/min恒溫振蕩箱中黑暗培養24 h的Aec23菌株，以CTAB法[14]提取細菌基因組DNA為模板，以27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1504R（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）為上、下游引物擴增其16S rDNA序列。PCR體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 μL，引物27F/1504R（10 μmol/L）2.0 μL，模板DNA（約50.0 mg/mL）1.0 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O補充至25 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、53 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min 40 s，30循環，72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳并回收目標片段，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果用BLAST軟件在GenBank進行同源性比較，以Clustal X[15]進行多序列比對后，用MEGA 5.0的Neighbor-Joining法[16]構建系統發育樹，并進行1 000次Bootstraps檢驗。

1.2.6 數據分析與處理方法 所測數據采用SPSS 17.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 桐花樹內生細菌總量及動態變化

用吖啶橙染色熒光顯微計數法測定桐花樹內生細菌總量結果表明（表1），桐花樹根莖葉內含有大量的內生細菌，不同時間、不同部位其內生細菌的數量有所不同。根部和葉部不同月份數量變化趨勢基本相同，內生細菌總量分別為0.88×107～49.67×107、1.07×107～65.07×107 ind./g FW，均在7月份數量最大，其不同時間數量變化趨勢為7月>3月>5月>9月>11月>1月；莖部內生細菌總量為1.1×107～19.73×107 ind./g FW，5月份達到最大值，各時期數量變化趨勢為5月>7月>11月>9月>3月>1月。葉部內生細菌的數量顯著高于莖部和根部。

2.2 桐花樹可培養內生細菌數量及動態變化

可培養內生細菌測定結果表明（表2），桐花樹根莖葉中可培養內生細菌數量隨部位和時間變化不同。各部位可培養內生細菌數量均在3月份數量達到最大值，根部和莖部可培養內生細菌含量周年變化趨勢相似，分別為1.02×103～13.18×103、0.13×103～11.24×103 CFU/g FW，各時期變化動態為3月>11月>7月>5月>1月>9月；葉部可培養內生細菌含量為0.31×103～10.36×103 CFU/g FW，其不同時間數量變化趨勢為3月>7月>9月>5月>11月>1月。通過比較發現，根部的可培養細菌含量較之莖部和葉部含量豐富。

2.3 植物病原拮抗菌株的篩選

本研究從桐花樹體內共分離獲得86株可培養內生細菌，以香蕉葉鞘腐敗病菌、芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌及馬拉巴栗疫霉病菌等植物病原細菌、真菌和卵菌等為供試菌，平板對峙測定發現，以來自桐花樹根部Aec23菌株對上述供試病原菌的抑菌效果最強且穩定（圖1），其抑菌圈直徑分別達（10.0±0.03）、（14.0±0.05）、（12.8±0.02）、（11.5±0.05）mm；進一步提取該菌株發酵上清液測定其抑菌圈直徑分別達（12.7±0.05）、（17.2±0.07）、（15.9±0.02）、（16.8±0.03）mm（圖2）。說明Aec23菌株對植物病原真菌、細菌和卵菌均有較強的拮抗作用。

2.4 拮抗菌株Aec23的鑒定

2.4.1 菌落形態特征觀察及生理生化測試結果 Aec23菌株在NA平板上菌落規則，圓形，邊緣加厚，乳白色，蠟質。生物顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性。生理生化測定（表3）：該菌株為好氧菌，厭氧條件不生長；可以使明膠液化，能水解淀粉和還原硝酸鹽，不能分解纖維素，不產生H2S；在pH5.7的培養基中可以生長，具有耐鹽性，可以在7%的NaCl培養基中生長；生長溫度為15～40 ℃，最適生長溫度為25～30 ℃；接觸酶試驗呈陽性，氧化酶、色氨酸脫氨酶及苯丙氨酸脫氨酶試驗均呈陰性；不產生吲哚；葡萄糖發酵產酸不產氣；甲基紅試驗呈陰性，乙酰甲基甲醇試驗呈陽性；不利用丙二酸，檸檬酸鹽生長試驗為陽性（指示劑藍色）。

2.4.2 菌株分子生物學鑒定 生防菌株Aec23的16S rDNA測序片段大小為1 515 bp（GenBank登錄號為KF181458），用BLAST軟件進行同源性比較，通過與GenBank中的核酸數據進行對比分析，菌株Aec23與解淀粉芽孢桿菌（登錄號：AY651023）同源性高達99.8%。以16S rDNA為基礎，利用MEGA 5.0軟件按Neighbor-Joining法構建了包括解淀粉芽孢桿菌及同屬的臨近種細菌在內的系統發育樹（圖3）。生防芽孢桿菌Aec23與解淀粉芽孢桿菌同處一支，遺傳進化距離最近。結合菌株的生化試驗及16S rDNA序列分析，生防芽孢桿菌Aec23初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3 討論

目前，細菌計數方法主要有平板直接計數法、熒光顯微計數法和流式細胞儀計數法等。較只分離可培養細菌的平板直接計數法[17]和前處理較復雜的流式細胞儀計數法[18]，熒光顯微計數法由于簡捷、快速、方便、可靠，且樣品易于保存，能較好反映樣品中細菌的實際數量，現已在多個領域應用[10]，但用于內生細菌含量測定卻鮮見報道。本研究采用吖啶橙熒光染色計數法對桐花樹內生細菌進行了分析，結果發現在顯微鏡下可觀察到大小、顏色和形狀各異的內生細菌，說明該法用于植物內生細菌含量測定是可行的，結果對植物內生細菌的相關研究具有一定的參考價值。

關于紅樹林內生菌的研究，目前以內生真菌和放線菌報道較多，鄧祖軍等[19]對桐花樹內生真菌類群進行了研究，發現不同部位、不同季節環境因素可直接影響內生真菌的定居和分布；唐依莉[20]等的研究結果表明，紅樹內生放線菌的定殖因宿主植物部位、年齡及季節和環境的變化明顯不同；相關性研究說明紅樹微生物數量動態變化受季節和分離部位的影響。本研究對桐花樹總內生細菌和可培養內生細菌數量測定結果表明，其細菌總量以5～7月份較高，而可培養細菌數最大值出現在3月份，說明桐花樹內生細菌總量及可培養細菌數量均隨采樣時期不同而顯示出明顯的波動。本研究結果還表明，桐花樹內生細菌總量與可培養細菌總量之間存在明顯差異，可培養細菌量僅占其總量的0.126‰ （0.005‰～0.768‰），說明桐花樹體內存在有大量的不能培養或難培養的細菌類群，這與相關研究報道結果相似。關于桐花樹內生細菌種群多樣性尚有待進一步研究。

近年來本實驗室利用紅樹內生細菌生防植物病害進行了較為系統的研究，已從紅樹植物老鼠簕、木欖和紅海欖體內分離獲得多株對香蕉枯萎病、芒果炭疽病、辣椒青枯病、辣椒疫病等植物病害具有較好防病作用的內生細菌菌株[21-24]。本研究又從桐花樹中篩選獲得1株對香蕉葉鞘腐敗病菌等植物病原細菌和真菌均有明顯抑制效果的Aec23菌株，進一步說明紅樹植物內生細菌是植物病害生物防治不可多得的資源[23]。有關Aec23菌株防病效果及防病機理等尚有待進一步研究。

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