DNA條形碼技術及其在畜牧產品中的應用前景

廖俊 應孟周 張曉芹 顧選2

[摘 要] 近年來，隨著國際上DNA條形碼技術的發展，中國也越來越多的將DNA條形碼技術應用到植物及中藥材的鑒定及相關研究中，然而此技術在畜牧產品中的應用卻還少見報道。本文綜述了DNA條形碼技術的原理、方法流程及其在動物研究中的應用，并對DNA條形碼在畜牧產品中的應用前景進行展望。

[關鍵詞] DNA條形碼 COI 畜牧產品 前景

[中圖分類號] Q819 [文獻標識碼] A [文章編號] 1003-1650 （2014）01-0252-02

近年來，DNA條形碼技術受到了國際和國內的高度關注，并在動植物的鑒定領域得到了廣泛應用。DNA條形碼技術首先是由Tautz[1]等在2002年提出，并將其應用于生物分類系統，Hebert等[2，3]在2003年首次提出DNA條形碼（DNA Barcoding）概念，并將其用于快速鑒定物種的標記物。到目前為止，國際上已經建立了包括生命條碼聯合會（Consortium forthe Barcode of Life， CBOL，http：// w ww.barcodeoflife.org），生命條碼數據庫（Barcode of Life Datasystems， BOLD，http：//www.boldsystems.org），以及國際生命條碼計劃（International Barcode of Life， iBOL，http：//www.ibol.org）在內的3個大型資源網站，吸引了50多個國家的投資者及合作組織。這些生命條碼組織的成立，進一步推動了DNA條形碼技術的發展。近年來，中國本土也形成了很多包括植物、動物及中藥材在內的生物DNA條形碼數據庫，為物種鑒定及生物系統發育研究的發展提供了有力的基因證據。

一、DNA條形碼技術的原理

條形碼技術是一種通過對條形碼進行電子掃描，從而實現對信息進行快速、準確的自動識別方法，目前已廣泛應用與商品零售業[4]。DNA條形碼與之類似，即利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定及其相關研究。DNA序列是由A、T、G、C 4種堿基組成，不同的堿基數目分別以不同的順序進行排列組合就會有足夠多數目的基因序列，從而包括所有物種的基因型[5，6]。

二、DNA條形碼操作的方法流程

1.樣品處理及DNA提取 首先對樣品進行液氮冷凍及酒精消毒等處理工作。其次是進行DNA提取，DNA提取方法一般包括破碎細胞壁并釋放DNA，分離DNA，純化DNA，DNA濃縮、沉淀與洗滌等基本步驟[7]。目前常用的DNA提取方法有CTAB[8]法，高鹽低PH[9]法，SDS[10]法以及試劑盒提取法等。對于植物樣品，一般選擇CTAB法 [11]，對于動物樣品，一般采用SDS（十二烷基硫酸鈉）原理提取DNA [12]。隨著近年來DNA提取試劑盒的問世，試劑盒法已經廣泛用于動植物DNA的提取。

2.PCR擴增

PCR（聚合酶鏈式反應）擴增就是使提取出的樣品DNA在PCR擴增儀內進行反應，以達到DNA的數量成指數增長的效果。對于植物PCR擴增，目前國內一般采用葉綠體基因[13，4]和核基因[15]片段為目的基因。對于動物的PCR擴增，國內應用最多的動物條形碼是COI基因。另外，線粒體基因以及核基因也越來越多的被用于動物研究中。

3.PCR產物檢測及測序

目前，一般采取瓊脂糖凝膠電泳方法檢測 PCR產物，采用Sanger雙向測序的方法。隨著高通量測序技術的發展，國內的測序技術也在進一步提高。

4.獲得DNA條形碼 將測序返回的結果利用Choromas軟件查看峰圖質量，ContingExpress軟件進行雙向序列拼接，Bioedit軟件進行序列編輯，最終獲得DNA條形碼。

三、DNA條形碼技術在動物研究中的應用

1.DNA條形碼在昆蟲中的應用

早在21世紀初，我國學者就已經利用線粒體COI基因對線蟲、蛔蟲、水蚤和吸蟲等線形動物進行了序列差異研究。之后Hajibabaei M等基于COI基因對鱗翅目521種昆蟲進行了序列分析，發現對其物種鑒別效率可以達到97.9%。潘程瑩等對7種蝗蟲的線粒體COI基因進行了研究，發現基于COI基因可以實現對蝗蟲的鑒別，并揭示了蝗蟲的系統進化歷程。這表明DNA條形碼在昆蟲類的鑒別研究中已經相當成熟。

2.DNA條形碼在魚類中的應用

DNA條形碼在魚類中的開發和應用也較為廣泛。Ward等對澳大利亞207種海洋魚類進行分析，發現所有物種在COI基因上都有一定差異，通過系統發育關系的構建，發現COI基因可作為海洋魚類DNA條形碼的標準序列。此外，Zemlak等用COI基因研究印度洋沿岸35種魚的229個樣本發現，南非和澳大利亞海域的同種魚類存在很大的差異，指出南非和澳大利亞海域應該還有很多隱存種沒有被人發現。王中鐸等利用COI基因對南海硬骨魚類進行研究時發現，COI基因可用于硬骨魚類的物種鑒別，并可用于低級分類階元的系統進化分析。這些研究表明，COI基因不僅可以用于動物物種的鑒定，還可以用于分析物種的系統進化歷程，尋找物種基因差異性原因，這對于動物隱存種的發現及生物多樣性的保護具有一定的實際意義。

3.DNA條形碼在軟體動物中的應用

軟體動物種類較多，現存種類大約8萬種，為世界第二大門類，目前海洋生軟體動物已有不少報道。Johnson等對20個種類的帽貝（Lepetodrilus limpets）進行分析發現，大部分種都可以通過COI基因進行區別開。Mikkelsen等[對12種雙殼類的COI基因進行分析，結果顯示種內差異和種間差異沒有重疊，COI基因還可以作為雙殼類的DNA條形碼。COI基因由于其具有較快的進化速率，且PCR擴增較容易，已經越來越多的被應用到軟體動物的鑒別研究。

4.DNA條形碼在鳥類中的應用

哺乳動物是和人類生產活動密切相關的一類動物，目前對于哺乳動物DNA條形碼研究還較少，主要研究集中在鳥類動物上。Efe等基于包括COI 和Cytb在內5種基因片段對瀕危動物白嘴端燕鷗的研究發現，該物種還存在兩個隱存種。Fleischer等[利用12SrDNA等6種線粒體基因對10種瀕危象牙嘴啄木鳥的親緣關系進行研究，結果表明其中7個來自北美洲自然博物館，3個來自古巴野生種。Webb等[還利用COI基因，Cytb基因及12S基因對啄木鳥科部分鳥類進行系統發育相關研究，結果表明美洲類群的啄木鳥是來自于歐亞類群的入侵種。DNA條形碼在鳥類中的應用研究比較廣泛，其在揭示鳥類的進化歷史，物種遷徙以及遺傳漂變方面發揮了重要作用。

四、DNA條形碼在畜牧產品中的應用前景

目前，DNA條形碼技術在常用畜牧產品中的研究還比較少，國內僅有幾篇文獻開展了類似研究。李新光等[35]利用COI基因對外在形態一致的冷凍魚、凍魚片及烤魚片中的魚肉成分來源進行了鑒別，結果發現10 種凍鱈魚片樣品主要以“狹鱈”為主（7/10），存在將“白鱈魚”標識為“銀鱈魚”的現象；烤魚片樣品與其標簽上所標識的原料多數不符，一些烤魚片還發現有月尾兔頭鲀，說明DNA條形碼技術可以用于畜牧產品的來源鑒定。徐向明[36]以我國3個地方品種鴨為研究對象，通過測定COI基因，發現3個地方的品種鴨具有與其他地方相區別的單倍型，并且也分別具有其各自的特異單倍型，說明利用COI基因可以鑒別不同地方鴨的品種。張蓉等[利用COI基因對市場上的花鹿茸，馬鹿茸及其混偽品進行了準確的鑒別，進一步說明了DNA條形碼在畜牧產品品種鑒別上的可行性。此外，Wang 等[通過測定浦東白豬和沙烏頭豬線粒體控制區（mtDNA D-loop）序列，并利用太湖流域其他地方豬在GenBank里的序列信息，對這些地方豬的系統發育關系進行了分析，結果表明，太湖流域的這些地方豬種的系統發育樹分為兩大支，而浦東白豬只分布在其中的一支內，估計大約在0.26～0.75 億年以前，浦東白豬與其他四種豬就已經分離開來，也就說浦東白豬是一個獨立的地方豬種，與其他地方豬沒有基因交流，應該作為一個單獨品種進行保護。

畜牧產品在我國市場上占據相當大的比例，隨著養殖業的發展，畜牧產品在市場上所占據的比例也會逐步增加，如何確保畜牧產品的來源準確，品種精確已經成為畜牧業發展中所面臨的一個新問題。DNA條形碼技術的發展給畜牧業帶來了新的啟發，尤其是對于外在形態相似的畜牧產品來說，運用DNA條形碼技術對其進行準確的來源鑒定將對控制畜牧產品的品種與質量，維護市場秩序，保證消費者及第三方利益具有重要的意義。另外，目前在畜牧業發展中保護稀缺品種也是實現畜牧業可持續發展的一個重要舉措，基于DNA條形碼技術可以估計物種的遺傳多樣性及系統進化歷程，推測物種的起源中心，將其應用于畜牧業中瀕危物種的保護也具有一定的可行性。因此，DNA條形碼技術在畜牧產品中具有極大的應用前景，將其引進并合理應用對于畜牧業發展具有非常重要的意義。

參考文獻

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作者簡介：廖俊，（1979-），男，漢族，助理畜牧師，麗水市松陽縣畜牧獸醫局；

通訊作者：劉春生，男，漢族，北京中醫藥大學教授、博士生導師，研究方向為藥用植物和分子生藥學。