人類Ago2蛋白與腫瘤的關(guān)系研究

林愛琴 趙躍華

摘要 Argonaute2（Ago2）蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNAinduced silencing complex、RISC）的核心元件，不僅在miRNA/siRNA通路中促使靶mRNA降解或抑制其蛋白質(zhì)翻譯，調(diào)節(jié)miRNAs生物合成和成熟，對生物生長發(fā)育、干細(xì)胞分化和腫瘤形成等有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞 Argonaute2；RISC；翻譯抑制；腫瘤

中圖分類號 S188 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03169-03

Abstract Argonaute2（Ago2） protein， the core of RNAinduced silencing complex（RISC）， complexed with the guide strand of a small interfering RNA（siRNA） or a microRNA（miRNA） and ubiquitously expressed and binded to siRNAs or miRNAs to guide posttrascriptional gene silencing either by destabilization of the mRNA or by translational repression. It has important functions in processes as diverse as embryonic development， cell differentiation and tumor biogenesis.

Key words Argonaute2； RISC； Translational repression； Tumor

Ago蛋白最初是從一種黑腹果蠅S2細(xì)胞中分離出來的，后來發(fā)現(xiàn)在生物體中廣泛分布且結(jié)構(gòu)高度保守，它們都是分子量大約都在100 kD的堿性蛋白[1]，又名為GERP95（Golgi ER Protein 95 ku）即與高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)的蛋白。多種生物基因組分析表明，不同種群參與Ago編碼的基因數(shù)量從1～27不等[2]。哺乳動物有8個基因參與編碼Ago，這個家族成員在結(jié)構(gòu)上典型特征是Ago的N端含有130氨基酸的PAZ結(jié)構(gòu)域、Mid結(jié)構(gòu)域和在C末端含有300個氨基酸組成的Piwi結(jié)構(gòu)域[3]，這3個結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏go蛋白的功能發(fā)揮著重要作用。雖然Ago家族成員都具有類似的結(jié)構(gòu)，但研究表明只有Ago2才是RISC中功能組分[4]。筆者就人類的Ago2結(jié)構(gòu)與功能進行綜述。現(xiàn)報道如下。

1 人類Ago2結(jié)構(gòu)研究

2002年，Martinez等在siRNA 3′端標(biāo)記生物素，在人Hela細(xì)胞抽提物中得到了與siRNA結(jié)合蛋白復(fù)合物，從中鑒定出了2個相對分子量為100 kD蛋白，即Ago1和Ago2[1]。有8個基因參與編碼人類Ago蛋白，其中有4個基因編碼Ago亞族的Ago1、Ago3、Ago4和Ago2，Ago1、Ago3、Ago4定位于1號染色體（1p34～35）區(qū)帶，Ago2定位在8號染色體；另4個基因編碼Piwi亞族的HIWI1、HIWI2、HIWI3 和HIWI4蛋白，依次定位于12、11、22和8號染色體。人類Ago2由4個區(qū)域組成，N端、PAZ結(jié)構(gòu)域、Mid結(jié)構(gòu)域和Piwi結(jié)構(gòu)域。PAZ結(jié)構(gòu)域是一個由6條鏈構(gòu)成的左手β桶，在桶的一端連接有2個螺旋，另一端連接1個αβ組件，在β桶與αβ組件之間形成1個口袋狀結(jié)構(gòu)，恰好可以插入RNAs 5′末端突出的2個堿基，這就是siRNA的結(jié)合位點。Mid結(jié)構(gòu)域與小RNAs的5′端磷酸結(jié)構(gòu)結(jié)合將小RNAs與Ago蛋白錨定（或嚙合）。Mid結(jié)構(gòu)域中還含有1個高度保守的motif結(jié)構(gòu)，其與elf4E（eukaryotic translational initiation factor 4E）的7甲基鳥嘌呤（m7G）帽結(jié)構(gòu)相似。正是這個類似m7G帽結(jié)構(gòu)阻止人Ago2與elf4E的結(jié)合，從而對靶mRNA的轉(zhuǎn)錄起始起到阻遏作用。Piwi結(jié)構(gòu)域是1種屬于RNase.Ⅲ家族結(jié)構(gòu)域，均含有螺旋包圍的5個片層結(jié)構(gòu)，Piwi與RNase.Ⅲ一樣催化切割siRNA與RNA形成的dsRNA中的單鏈RNA，因而具有核酸內(nèi)切酶的活性[1]，切割產(chǎn)物具有3′OH和5′磷酸結(jié)構(gòu)，Piwi結(jié)構(gòu)域中的Piwibox區(qū)（盒）可以直接與Dicer酶結(jié)合[2]。Liu等[5]在293T細(xì)胞中證明Ago14都能與siRNA結(jié)合，但只有Ago2具有“切割”活性，在小鼠中敲除Ago2基因出現(xiàn)一些異常的發(fā)育從而導(dǎo)致胚胎死亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)人類Ago2“切割”（即核酸內(nèi)切酶）活性中心由Asp597、Asp669、和His807 3個氨基酸組成，若Ago2的D669位點突變，Ago2功能喪失[6]。

2 Ago2的裝配研究

Ago2具有抑制蛋白質(zhì)翻譯和促進miRNA、piRNAs生物合成和成熟的miRNA表達的功能，Ago2是RISC的核心成分，與miRNA與siRNA結(jié)合構(gòu)成RISC通過堿基互補原理與靶miRNA完全或不完全互補結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)的。Ago2的裝配過程也就是RISC的形成過程，可分為起始階段和效應(yīng)階段。

2.1 起始階段 主要是內(nèi)源性或外源性長鏈RNA（dsRNA）在Ago2介導(dǎo)下生物合成成熟的miRNA、siRNA或piRNA的過程。首先DNA重復(fù)序列編碼長鏈miRNA，由Diosha對細(xì)胞核里miRNA前體進行剪切，核膜蛋白主動運輸于細(xì)胞質(zhì)中，再被Dicer酶剪切掉莖環(huán)部成為成熟的長約18～24核苷酸的雙鏈miRNA。Dicer酶還能對外源性dsRNA分子加工成小的雙鏈siRNA[3]。

2.2 效應(yīng)階段 與以往觀點不同最新研究認(rèn)為，目前認(rèn)為雙鏈RNA（dsRNA）在Ago2介導(dǎo)下結(jié)合RISC并生成2條單鏈（即正義鏈和反義鏈）是不依賴ATP的[7]，其中反義鏈與Ago2的PAZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成Ago2的核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體。siRNA與靶mRNA序列之間是完全或接近完全互補的。Ago2介導(dǎo)對轉(zhuǎn)錄本剪切在距離單鏈siRNA5′10nt的位點進行。miRNA與靶mRNA 5′端UTR位點不完全互補產(chǎn)生翻譯抑制，其反應(yīng)關(guān)鍵特征是：miRNA和靶mRNA之間存在序列錯配[4]。RISC在形成過程中還需要其他蛋白的參與，如TRBP和PACT。

2.3 Ago2裝配過程幾個關(guān)鍵問題的探討 Ago2裝配中的dsRNA“不對稱”的選擇：RISC/ Ago2是如何判定降解dsRNA正義鏈的？Khvorova等[8]分析了siRNA鏈兩端的熱動力學(xué)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)反義鏈5′端的熱力學(xué)穩(wěn)定性差，因而被保留進入RISC復(fù)合體成為向?qū)ф湥腥藢⑦@一現(xiàn)象稱為“不對稱原理（asymmetry rule）”。

Ago2在RNAs沉默途徑中的“脫靶”效應(yīng)：在RNAs沉默途徑中，Ago2因其沒有序列特異性，可與各種不同序列小RNAs結(jié)合，形成RISC。為確保Ago2與小RNAs精確結(jié)合而不是降解這些效應(yīng)分子，導(dǎo)致“脫靶”效應(yīng)。這條沉默途徑還需要1個特定的結(jié)構(gòu)構(gòu)成監(jiān)視系統(tǒng)，這種監(jiān)視系統(tǒng)可能是小RNAs的5′末端突出的2個堿基恰好插入Ago2的PAZ結(jié)構(gòu)域的口袋狀結(jié)構(gòu)[2]。另外，小RNAs與RISC結(jié)合誘導(dǎo)靶mRNA降解，需要小RNAs的5′端磷酸化結(jié)構(gòu)與Ago2的Mid結(jié)構(gòu)域錨定[9]。

Ago2在裝配中的篩選和修飾作用：人體內(nèi)Dicer只發(fā)現(xiàn)1種，而人的miRNA已報道1 800多種（miRBase），外源性siRNA種類更多。盡管Dicer含有多種功能的結(jié)構(gòu)域，但對眾多的siRNA/miRNA結(jié)合與切割是否存在篩選，未見報道。人類Ago亞族有4種蛋白即hAgo1～4，目前只發(fā)現(xiàn)Ago2具有核酸內(nèi)切酶活性，Dicer募集哪一種Ago組裝RISC，其篩選機制、有報道認(rèn)為可能與靶mRNA堿基互補精確度及互補鏈末端結(jié)構(gòu)相關(guān)[10]。

miRNA的5′端的2～7個堿基是miRNA識別的關(guān)鍵，siRNA的5′端的磷酸化是siRNA識別關(guān)鍵。Filipowicz[11]認(rèn)為當(dāng)miRNA的堿基配對核心區(qū)與靶mRNA形成完全互補雙鏈時，這種雙鏈可形成A型螺旋與Ago2的DDH氨基酸結(jié)構(gòu)區(qū)結(jié)合，miRNA可以對轉(zhuǎn)錄體切割降解，當(dāng)不完全配對影響A型螺旋的形成時則表現(xiàn)出對轉(zhuǎn)錄體翻譯抑制。Ago2具有的核酸內(nèi)切酶活性還可以對靶mRNA堿基錯配或環(huán)狀突起堿基異常結(jié)構(gòu)進行切割修飾。

Ago2在RNAs沉默途徑中的抑制蛋白合成機制：Ago2在與miRNAs結(jié)合形成RISC后，靶向mRNA進入胞質(zhì)處理小體（pbodies），進而通過3種方式抑制蛋白質(zhì)合成：①誘導(dǎo)mRNA脫腺苷酸化和脫帽，啟動mRNA降解；②通過Ago2和翻譯起始因子競爭與mRNA M7G帽子的結(jié)合，阻礙功能性核糖體的裝配，造成翻譯起始抑制；③通過募集多肽鏈降解（翻譯延伸）相關(guān)的細(xì)胞因子（肽酶、翻譯后修飾酶）使核糖體脫離肽鏈或新合成的肽鏈迅速降解，這一過程發(fā)生在翻譯起始后[12]。免疫熒光定位證明，Ago2大多定位于細(xì)胞質(zhì)中，并在P小體中富集，參與上述的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。但仍有一小部分Ago2定位于細(xì)胞核中，它們作用于DNA啟動子區(qū)域，使靶基因和組蛋白甲基化，從而抑制基因表達。最近發(fā)現(xiàn)Ago2介導(dǎo)的miRNA在無血清細(xì)胞的AU富集區(qū)域，可以增強轉(zhuǎn)錄本的翻譯。有人估計，在人類基因組中大于30%的基因的表達都受與Ago相關(guān)的RNAi現(xiàn)象的調(diào)控[13]。探索Ago2在人類細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞相關(guān)性研究已成為腫瘤的基因診斷和治療的新亮點。

3 Ago2與腫瘤的關(guān)系

3.1 Ago2過表達與腫瘤的關(guān)系 Ago家族蛋白與多種腫瘤密切相關(guān)，hAgo1、hAgo3和hAgo4基因前后排列在人1號染色體p34～35，在wilms腎癌中經(jīng)常缺失，還與神經(jīng)外胚層瘤相關(guān)[14]。hAgo1在肺和腎的發(fā)育過程中高表達，在缺少wilms腫瘤抑制基因WT1的腎癌中過表達[15]。在對人類乳腺癌MCF7、宮頸癌Hela、肺腺癌A549和胚腎細(xì)胞HEK293這4種細(xì)胞系中Ago1～4的轉(zhuǎn)錄圖譜顯示，其細(xì)胞系普遍存在穩(wěn)定表達，其中Ago2和Ago3轉(zhuǎn)錄水平較高且相對穩(wěn)定。Zhang等[16]研究227例卵巢癌、乳腺癌及黑素瘤標(biāo)本的miRNA表達譜，同時分析miRNA靶基因的DNA拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3種腫瘤中Ago2的DNA拷貝數(shù)的變異率均明顯增加。對乳腺癌的進一步研究顯示：Ago2在侵襲性較高的乳腺癌、basellike、HER2過表達和luminal B型的表達增高，且在ER-乳腺癌表達高于ER+乳腺癌患者，說明Ago2過表達與乳腺癌的侵襲程度密切有關(guān)[17]。Li等用microarray的方法對150例結(jié)腸癌標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本Ago家族進行檢測，發(fā)現(xiàn)Ago2在結(jié)腸癌中表達高于癌旁組織，提示Ago2的表達與腫瘤進展及侵犯有關(guān)[18]。

Cheng等在肝癌組織與相鄰非腫瘤肝組織的對比研究中發(fā)現(xiàn)Ago2在肝癌組織中表達頻繁上調(diào)[19]，有趣的是，Ago2的過度表達可以促進體內(nèi)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移、致瘤性以及轉(zhuǎn)移等；與此相反，Ago2的敲低可以限制非依賴性集落形成，遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移。Shaughnessy等用基因芯片技術(shù)研究了高危多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者基因表達譜改變，確定了70個疾病早期死亡相關(guān)的基因，Ago2是其中一個，這證明Ago2的表達與MM早期死亡有關(guān)[20]。Parisi[21]等研究表明Ago1和Ago2在SHSY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中過度表達且影響細(xì)胞的增殖，遷移和凋亡。國內(nèi)研究證明：Ago2在結(jié)腸癌[22]、胃癌[23]、膀胱尿路上皮癌[24]等組織中的表達高于正常組織。

3.2 Ago2介導(dǎo)的RNA沉默途徑與腫瘤的關(guān)系 在人類的RNA干擾中，Ago2是目前唯一具有RNA酶切活性的蛋白，控制miRNA和siRNA對靶mRNA的剪切分解，從這個角度說Ago2應(yīng)該是惟一可能與腫瘤相關(guān)的蛋白。有人在MM患者miRNAs的表達譜中發(fā)現(xiàn)Ago2的表達增高與其DNA拷貝數(shù)增加密切相關(guān)，在高危組Ago2和大部分miRNAs表達均顯著上調(diào)，與MM高危因素呈正相關(guān)性。Zhou發(fā)現(xiàn)，Ago2功能沉默后的骨髓瘤細(xì)胞株活性明顯降低，用qPCR檢測Ago2有活性和失活的骨髓瘤細(xì)胞株中miRNA的表達，發(fā)現(xiàn)Ago2失活后的細(xì)胞株miRNA功能下調(diào)[25]。但在骨髓瘤病例標(biāo)本中，Ago2與miRNA的表達量沒有顯著的正相關(guān)，說明Ago2在骨髓瘤細(xì)胞中可能存在其他調(diào)節(jié)通路。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Ago2介導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡還可以通過caspasa3、caspasa8和caspasa9信號通路。Karanti對60例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）標(biāo)本和27種DLBCL細(xì)胞株，對與人類疾病相關(guān)的471種miRNA和涉及miRNA生成的17種基因進行研究[26]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，95%的淋巴瘤標(biāo)本和100%的淋巴瘤細(xì)胞株miRNA基因異常，包括基因的增多和丟失。對17種參與miRNA合成的基因研究中發(fā)現(xiàn)，Ago2基因異常超過10%。

Chiyomaru等發(fā)現(xiàn)Ago2通過miR141介導(dǎo)HOTAIR基因沉默，他們通過轉(zhuǎn)染Ago2的siRNA至786O細(xì)胞中的觀察到Ago2的siRNA下調(diào)Ago2的表達和miR141減少內(nèi)源性HOTAIR表達至20%，但是沒有觀察到Ago2敲低時HOTAIR的顯著下降，表明HOTAIR基因沉默在很大程度上是Ago2通過miR141介導(dǎo)的[27]。

Zhang等發(fā)現(xiàn)在293T和H1299細(xì)胞系中穩(wěn)定的Ago2的過度表達能引起miRNA和mRNA的表達特異性改變，但研究同時發(fā)現(xiàn)Ago2的表達在人肺腺癌組織中低于配對非癌組織[28]。可見變化的Ago2表達可能在體內(nèi)引起顯著的生理和病理變化。Naoghare等研究表明敲低Ago2能誘導(dǎo)骨髓性白血病細(xì)胞的凋亡和抑制在HEK293細(xì)胞系中癌基因轉(zhuǎn)染的siRNA介導(dǎo)的基因沉默[29]。Ago2是miRNA從RNA靶分子上形成的一個關(guān)鍵因子，在惡性腫瘤的形成過程中，miRNA和Ago2的相互作用可能是復(fù)雜的，其可能機制是：作為RISC活性中心，Ago2的增多選擇性保護了miRNA，防止其被降解，從而抑制抑癌基因的作用，促進腫瘤的生長。還有一種可能是：Ago2的表達除了促進腫瘤的生長外，還可引起表型的改變。

3.3 Ago2與腫瘤細(xì)胞周期的關(guān)系 人類腫瘤細(xì)胞中Ago2蛋白可直接或間接地參與細(xì)胞周期進程的調(diào)控。在人類基因組中大于30%的基因的表達都受與Ago相關(guān)的RNAi現(xiàn)象所調(diào)控。許多有RNAi通路控制的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)蛋白，從而調(diào)節(jié)信號通路和細(xì)胞周期進程。試驗證明，Ago蛋白表達沉默會導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性顯著下降，生長受抑。Ago1～ Ago4基因沉默所致的細(xì)胞增殖活性隨Ago下調(diào)時間的延長而持續(xù)下降。其中Ago2沉默所致的細(xì)胞生長抑制程度最大，可能與細(xì)胞周期進程的調(diào)控關(guān)系更為緊密。進一步研究揭示，Ago蛋白的表達缺失導(dǎo)致其細(xì)胞周期在G0/G1期發(fā)生停滯，細(xì)胞不能正常進入S期完成DNA復(fù)制，從而抑制增殖。Ago2蛋白也可通過miRNA途徑間接的影響細(xì)胞正常生長增殖。最新發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅可以靶向mRNA 3′UTR對蛋白質(zhì)表達進行負(fù)控制[30-31]，還可以激活mRNA翻譯[32]，而兩種控制機制的轉(zhuǎn)換則依賴于細(xì)胞周期的狀態(tài)。如miR3693在G1期阻滯時激活轉(zhuǎn)錄，當(dāng)細(xì)胞正常生長時則抑制轉(zhuǎn)錄。而無論正負(fù)調(diào)控都需要Ago2蛋白的參與，那么Ago2蛋白的缺失就可能會對miRNAs調(diào)控通路造成影響，進而影響細(xì)胞增殖。在人類腫瘤細(xì)胞中Ago2蛋白對其細(xì)胞生長和增殖起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。Ago2蛋白表達沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性顯著下降，細(xì)胞周期在G0/G1期發(fā)生阻滯，生長受抑。揭示Ago2蛋白可能直接或間接地參與細(xì)胞周期進程的調(diào)控。

4 小結(jié)與展望

siRNA/miRNA可通過抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期控制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡等過程中的特定和關(guān)鍵靶基因而發(fā)揮抗癌的作用，目前已在多種腫瘤治療方面取得成效。但是，從已知的超過2 000個與腫瘤相關(guān)的編碼基因中尋找腫瘤生物治療特異而有效地靶基因有較大的難度。在人類的miRNA和siRNA的形成過程中，Ago2蛋白的結(jié)合是其關(guān)鍵步驟，因而Ago2應(yīng)該是惟一可能與腫瘤相關(guān)的蛋白。諸多研究數(shù)據(jù)亦證明Ago2基因在腫瘤中的復(fù)制時增強的。Ago2介導(dǎo)的siRNA/miRNA調(diào)控通路為腫瘤的基因治療提供了一種新的具有高效性和高度特異性的研究策略，其干擾治療腫瘤的主要原理為在特定的組織細(xì)胞中引入雙鏈RNA，誘導(dǎo)序列特異的靶基因的沉默，從而迅速阻斷基因活性。然而，到目前為止，Ago2基因和蛋白仍有許多功能不為人所知，需要我們繼續(xù)探索、發(fā)現(xiàn)。

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