轉基因擬南芥中雌激素誘導的轉錄激活系統誘導條件的優化

胡曉龍等

摘要 [目的]探索雌激素誘導的轉錄激活系統（XVE）在擬南芥中高效表達外源蛋白的條件。[方法]構建XVEAtNFYA10：3×flag植物表達載體，轉化擬南芥并獲得了陽性植株；采用3種不同的誘導表達條件對外源蛋白的表達量進行檢測。[結果]1/2MS培養基生長10 d后的擬南芥轉基因苗外源融合蛋白表達量最高，進一步研究表明1/2MS培養基生長10 d后的擬南芥轉基因苗在受誘導后8、16、24和32 h外源融合蛋白均有表達，在16 h時表達量達到最高，并持續到32 h。[結論]AtNFYA10：3×flag融合外源基因最優表達條件為1/2MS培養基生長10 d后的擬南芥轉基因苗雌激素誘導16 h。

關鍵詞 雌激素；轉錄激活系統；擬南芥；蛋白表達

中圖分類號 S188；Q812 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03175-04

Abstract [Objective] To optimize the protein expression using an estrogeninduced transcriptional activation system. [Method] The plasmid XVEAtNFYA10：3×flag was constructed and transferred into Arabidopsis， and the positive plants were obtained. Three approaches were used to test the protein expression level. [Results] The data showed that the protein expression level came to a head in tenday old transgenic Arabidopsis on the 1/2 MS medium， and the protein was induced to express 8 hour later， and reach a peak from 16 hours to 32 hours. [Conclusion] The best condition for AtNFYA10：3×flag protein expression in Arabidopsis was tenday old Arabidopsis induced for 16 hours.

Key words Estrogen； Transcriptional activation system； Arabidopsis thaliana； Protein expression

目前已從動物、植物、病毒及微生物中分離到許多適用于植物基因工程的啟動子。按照其作用方式和功能可分為3類：組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子。組成型啟動子驅動基因表達方式不受時間、部位、誘導物質的影響，在所有組織中都啟動基因表達，在植物基因工程中得到了大量的研究和應用。如花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子[1]、水稻肌動蛋白基因（actin1）的啟動子[2]和玉米泛素基因（ubiquitin）的啟動子[3]等都是常用的啟動強度很高的組成型啟動子。由于不同物種之間有較大差異，不同來源的強啟動子在異源系統中不一定都表現出強驅動能力。CaMV）35S啟動子在煙草，擬南芥等雙子葉植物系中都表現出非常高的啟動活性，但是在大麥中則幾乎沒有啟動活性[4]。另外由于其表達比較隨機，常導致外源基因在植物的全部發育時期所有組織中表達，產生大量異源蛋白質或代謝產物在植物體內積累，加重了植物的合成與代謝負擔，阻礙了植物的正常生長，甚至導致死亡[5]。組織特異性啟動子調控的基因則只在某些特定的器官或組織部位表達，此類啟動子克服了外源基因在受體植物中非特異性的持續、高效表達所造成的浪費，目前得到了廣泛的研究與應用[6-7]。但是如果需要外源基因大量表達時，特定組織部位則因表達量過低又達不到預期效果。誘導性啟動子，是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。與前面2類啟動子相比，該類啟動子可以快速有效地誘導轉錄基因的“開、關”，可根據需要誘導基因表達，這樣就不會造成植物體內資源的浪費或者在誘導前期過量表達影響植物的生長發育。誘導型啟動子常以誘導信號命名，可分為光誘導表達基因啟動子、熱誘導表達基因啟動子、創傷誘導表達基因啟動子、激素誘導表達基因啟動子、真菌誘導表達基因啟動子等[8]。

雌激素誘導的轉錄激活系統（XVE）包含2個控制目的基因表達的轉錄單元。第1個轉錄單元是強組成型啟動子G1090控制的融合基因序列。該融合基因序列由細菌抑制子LexA（X）的DNA結合區、VP16（V）反式激活區和人雌激素受體（E） 的調節區組成[9]。第2個轉錄單元包括八個拷貝的LexA啟動子序列、46 35S微型啟動子[10]以及外源目的基因。在沒有雌激素存在時，XVE融合蛋白的人雌激素受體（E） 的調節區與HSP90等胞內調節蛋白結合，作為單體定位在細胞質中，當有雌激素存在時，XVE融合蛋白的人雌激素受體（E） 的調節區結合雌激素，釋放HSP90，并二聚化轉運到核內，與外源目的基因上游8個拷貝的LexA啟動子序列結合，激活目的基因的表達[11]。利用報告基因GFP的研究表明，該系統經雌激素誘導之后，GFP的表達水平比由CaMV 35S驅動的GFP高8倍[9]。XVE系統由于其較低的本底表達水平以及高效表達的特性得到了廣泛的研究與應用[12]。但是不同的目的基因誘導表達效率可能不同，獲得表達量最大的時間點也可能與GFP有差異。另外以往的研究僅限于對該系統誘導后目的基因轉錄水平的檢測，對其翻譯水平的檢測鮮有報導。因此對于特定的目的基因在特定的轉基因材料里利用該系統表達外源蛋白的最優化誘導條件的探索就顯得很有必要。NFYA是一類結合CCAATbox的重要轉錄因子，包括3個亞基，NFYA、NFYB和NFYC[13]。在擬南芥中已鑒定了10個NFYA，13個NFYB和13個NFYC基因[14]。NFY家族在植物的生長發育及逆境反應中發揮了重要調控作用并受到miR169家族成員的調控[15-16]。實驗室一直致力于miR169/NFYA 模塊調控功能的研究，其中通過染色質免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）方法鑒定NFYA調控的下游序列是一個重要環節， 能否獲得大量表達的NFYA蛋白成為試驗成敗的關鍵，同時也為利用此系統表達其他蛋白建立一個技術體系。鑒于此，筆者以AtNFYA10為目的基因，構建由雌激素誘導的轉錄激活系統（XVE）調控其表達的植物表達載體，并轉化擬南芥獲得轉基因植株，對擬南芥的培養方式、雌激素使用濃度、施用方法、不同處理時間點的表達量等因素進行系統摸索，獲得一套適合于擬南芥中AtNFYA10高效誘導表達的方法，以期為今后其他同類基因的高效誘導表達及調控機制的解析提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。所用的野生型擬南芥為Col0生態型，大腸桿菌宿主菌為TOP10，農桿菌宿主菌為GV3101，均為實驗室保存。

1.1.2 主要試劑。pER8flag載體，由研究室宗娜博士饋贈，在3個flag序列的5′端有xhoI和BstBI 酶切位點；pEASYT1 Cloning Vector，購自北京全式金生物技術有限公司；Taq DNA Polymerase，購自北京澤星生物科技有限公司；限制性內切酶，均購自NEB公司，T4 DNA連接酶，購自Promega公司；麗春紅、Hygromycin B、PMSF和DTT，均購自Amresco公司；PVDF膜，購自MILLIPORE （Cat.No：ISEQ00010）；雌激素，購自Sigma公司（No.E8875，用DMSO溶解成10 mmol/L母液儲存于-20 ℃備用）；Protease Inhibitor Cocktail Tablets，購自Roche公司（No.04693132001）；Monoclonal ANTIFLAG抗體，購自Sigma公司（No.F1804）；熒光二抗Goat antiMouse IR Dye，購自ODYSSEY公司（No.C2102401）；膠回收試劑盒，購自Axygen公司；引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。測序由北京博艾永華生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 AtNFYA10flag融合基因誘導表達載體的構建。根據擬南芥AtNFYA10基因的cDNA序列，設計引物YA10flagFW：5′CTCGAGATGCAAACTGAGGAGC3′和YA10flagRV：5′TTCGGATATATTAAGTTTGCAGC AGCC3′，下劃線序列分別為xhoI和BstBI酶切位點。以cDNA作為模板，進行AtNFYA10基因CDS全長擴增。PCR產物亞克隆至pEASYT1載體，鑒定正確之后的質粒經xhoI和BstBI雙酶切，與經同樣雙酶切的pER8flag載體連接，獲得植物表達載體pER8AtNF10flag，表達載體轉化至宿主菌TOP10，菌落PCR法篩選出含有目的基因的重組子提取質粒。質粒經xhoI和BstBI雙酶切鑒定，挑選酶切鑒定正確的質粒送測序。挑選測序正確的質粒經電擊法轉至GV3101農桿菌感受態細胞，用PCR的方法來篩選陽性重組子。

1.2.2 轉基因擬南芥株系的獲得。運用蘸花法轉化擬南芥[17]，收取T0代種子，并用25 mg/L Hygromycin B進行抗性篩選。具有抗性的轉化苗再經PCR鑒定，獲得至少3個獨立轉化的株系。收獲T1代種子再經2次篩選獲得T3代純系，用于后續試驗研究。

1.2.3 擬南芥植株的培養。 ①土培法。營養土與蛭石1∶1混勻后將擬南芥幼苗移栽到土中，14 h光照/10 h黑暗，24 ℃/22 ℃（白天/夜間）培養，光照強度250 mEinsteins/m2·s。②水培法。將擬南芥幼苗用Hoaglands營養液[18]水培，培養條件同上。③1/2MS培養基培養。將擬南芥種子用70%乙醇+0.05%Triton X100溶液浸泡振蕩10 min后倒掉液體，再用95%乙醇清洗3次后用無水乙醇清洗1次，種子晾干后均勻播撒到1/2MS培養基上。置于24 h光照，24 ℃條件下培養，光照強度250 mEinsteins/m2·s。

1.2.4 雌激素誘導轉基因擬南芥表達外源AtNFYA10：3×flag融合蛋白。①土培材料的誘導處理。取轉基因擬南芥3個株系的T3代純系種子為材料，土培生長1個月后，用50 μmol/L雌激素噴灑葉片進行誘導。取16 h處理的擬南芥葉片3～4片放入加了小鋼珠的1.5 ml離心管中，液氮中迅速冷凍，于-70 ℃儲存備用，進行后續的westernblot檢測，每個試驗做3次生物學重復。②水培材料的誘導處理。取轉基因擬南芥3個株系的T3代純系種子為材料，Hoaglands營養液水培生長1個月后，用50 μmol/L雌激素噴灑葉片，并在培養液中加入5 μmol/L雌激素進行誘導處理。取16 h處理的擬南芥葉片3～4片放入加了小鋼珠的1.5 ml離心管中，液氮中迅速冷凍，于-70 ℃儲存備用，進行后續的western-blot檢測，每個試驗進行3次生物學重復。③固體培養基培養材料的誘導處理。取轉基因擬南芥3個株系的T3代純系種子為材料，放入無抗1/2MS培養基生長10 d后，轉移至加有5 μmol/L雌激素的1/2MS培養基繼續培養誘導。取16 h處理的擬南芥幼苗3～4棵放入加了小鋼珠的1.5 ml離心管中，液氮中迅速冷凍，于-70 ℃儲存備用，進行后續的western-blot檢測，每個試驗進行3次生物學重復。然后對3個株系進行進一步處理并于0、8、16、24和32 h分別取樣進行westernblot檢測，每個試驗同樣進行3次生物學重復。

1.2.5 AtNFYA10：3×flag融合蛋白表達量的Westernblot檢測。①植物總蛋白的提取。從-70 ℃冰箱中取出凍存材料，研磨至細末狀，加入100 μl的蛋白提取緩沖液（50 mmol/LTrisHCl，pH 8.0；120 mmol/L NaCl；10% Glycerol；Triton X100；5 mmol/L PMSF；10 mmol/L DTT；1×Protease Inhibitor Cocktail），劇烈振蕩十幾秒鐘，冰浴十幾秒鐘后繼續振蕩，反復多次直至混勻；4 ℃，14 000 r/min，離心15 min后于冰上吸取上清備用。②蛋白免疫印記（Western blot）。SDSPAGE膠的配置及樣品處理、上樣及轉膜等步驟參照Handbook of Immunoblotting of Proteins [19]，待轉膜結束，將PVDF膜取下，放入盛有麗春紅溶液的培養皿中，染色1～2 min；清水洗滌2～3遍，用熒光照相系統（Chemi DOCIt Imaging System，UVP）照相，選取Rubisco的大亞基為上樣對照；然后將PVDF膜放于用PBST配置的5%脫脂奶粉封閉液中，于搖床上室溫封閉處理2 h，加入一抗（1∶5 000），4 ℃振蕩過夜后PBST洗滌3次，每次5 min；加入二抗（1∶5 000），室溫遮光60 min，TBST洗滌3次，每次5 min；最后用ODYSSEY熒光照相系統對PVDF膜掃描，獲得目的蛋白的熒光條帶。

1.2.6 Western blot數值分析。以Rubisco大亞基蛋白麗春紅染色條帶作為上樣對照，用Image J軟件對麗春紅和熒光條帶進行定量處理[20]，熒光條帶值除以麗春紅條帶值所得數值即為樣品所含目的蛋白的相對表達量，以此數值再進行進一步分析。

2 結果與分析

2.1 雌激素誘導表達AtNFYA10：3×flag擬南芥轉基因植株的獲得 利用農桿菌介導的方法轉化擬南芥Col0花蕾，收獲種子后播種于含有25 mg/L Hygromycin的1/2 MS培養基。培養1月左右，挑選抗性小苗轉移到蛭石基質培養，待小苗長至5～6片葉時取葉提取基因組DNA進行PCR鑒定，鑒定陽性的植株收獲T1代種子。圖1為轉化植株的PCR鑒定結果，所用引物為YA10flagFW：5′CTCGAGATGCAAACTGAGGAGC3′和PER8R：5′GAAACCGATGATACGGAC3′。共獲得獨立轉化株系20個（圖1）。隨機取其中3個繼續培養獲得T3代純系，以此為材料進行下一步的研究。

2.2 不同培養方式雌激素誘導外源AtNFYA：3×flag融合蛋白表達的分析 分別對3種培養方式培養的3個擬南

3 結論與討論

試驗研究表明，在1/2MS培養基中24 h光照連續培養10 d的轉基因擬南芥幼苗，經5 μmol/L雌激素誘導培養至16 h，受轉錄激活系統XVE調控的NFYA10：3×flag融合蛋白表達量達到最高峰，然后略有下降后一直持續到32 h這個時間段都維持一個較穩定的狀態。也對土培法生長一個月的轉基因材料用50 μmol/L雌激素噴灑葉片的方式及水培法生長一個月的轉基因材料用50 μmol/L雌激素噴灑葉片和5 μmol/L雌激素灌根的方式誘導后進行了試驗。結果表明在培養基上生長10 d的幼苗對雌激素的應答最為敏感，外源基因的表達水平遠遠高于生長了1個月的擬南芥苗。因此選定1/2MS培養基生長10 d后的擬南芥轉基因苗雌激素誘導16 h為最優的AtNFYA10：3×flag融合基因表達條件，為后續的試驗工作的順利進行提供了條件，也為利用此系統表達其他外源蛋白提供了一個參考。同時根據試驗結果顯示出采用雌激素誘導的轉錄激活系統的轉基因擬南芥在不同的生長時期對于雌激素的誘導響應水平存在差異。這在研究文獻中鮮有報道。其中的原因還有待進一步闡明。

利用雌激素誘導的轉錄激活系統（XVE）誘導外源基因在擬南芥以及西紅柿轉基因植株中大量表達在科學研究中得到廣泛的研究與應用。但由于雌激素與植物內源雌激素形成共軛雌激素后會導致雌激素對該系統的誘導失效。所以該系統不適用于如大豆等內源雌激素水平高的植物物種中。另外由于雌激素大量使用會對環境產生污染以及雌激素受光照后不穩定[21]，此系統不適合應用于要進行田間實驗的植物中。所以開發表達效率更高應用范圍更廣泛的誘導轉錄激活系統也顯得很有必要。

參考文獻

[1]

JOAN T，ODELL，FERENC NAGY，et al.Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter[J].Nature，1985，313：810-812.

[2] MCELROY D，ZHANG W，CAO J，et al.Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation[J].The Plant Cell，1990，2（2）：163-171.

[3] CHRISTENSEN A H，QUAIL P H.Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants[J].Transgenic Res，1996，5（3）：213-218.

[4] JONES H D，SPARKS C A.Promoter Sequences for Defining Transgene Expression[J].Transgenic Wheat，Barley and Oats，2009，478：171-184.

[5] 路靜，趙華燕，何奕昆，等.高等植物啟動子及其應用研究進展[J].自然科學通報，2004，14（8）：856-866.

[6] 宋揚，周軍會，張永強.植物組織特異性啟動子研究[J].生物技術通報，2007（6）：21-24.

[7] CHEN R，XUE G，CHEN P，et al.Transgenic maize plants expressing a fungal phytase gene[J].Transgenic Res，2008，17（4）：633-643.

[8] 王志新，趙琳，李文濱.植物誘導型啟動子的研究進展[J].大豆科技，2011（3）：5-9.

[9] ZUO J R，NIU Q W，CHUA N H.An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants[J].The Plant Journal，2000，24（2）：265-273.

[10] BENFEY P N，REN L，CHUA N H.Tissue-specific expression from CaMV 35S enhancer subdomains in early stages of plant development[J].EMBO J Jun，1990，9（6）：1677-1684.

[11] ZUO J，CHUA N H.Chemical-inducible systems for regulated expression of plant genes[J].Curr Opin Biotechnol，2000，11（2）：146-151.

[12] ZUO J，HARE P D，CHUA N H.Applications of chemical-inducible expression systems in functional genomics and biotechnology[J].Methods Mol Biol，2006，323：329-342.

[13] NARDINI M，GNESUTTA N，DONATI G，et al.Sequence-Specific Transcription Factor，NF-Y Displays Histone-like DNA Binding and H2B-like Ubiquitination[J].Cell，2013，152：132-143.

[14] GUSMAROLI G，TONELLI C，MANTOVANI R.Regulation of novel members of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits[J].Gene，2002，283：41-48.

[15] PETRONI K，KUMIMOTO R W，GNESUTTA N，et al.The promiscuous life of plant nuclear factor Y transcription factors[J].The Plant Cell，2012，24：4777-4792.

[16] XU M Y，ZHANG L，LI W W，et al.Stress-induced early flowering is mediated by miR169 in Arabidopsis thaliana[J].Journal of Experimental Botany，2014，65（1）：89-101.

[17] CLOUGH S J，ANDREW F.Bent Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J].The Plant Journal，1998，16（6）：735-743.

[18] HOAGLAND D R，ARNON D I.The water-culture method for growing plants without soil[M].Berkeley：California Agricultural Experiment Station，University of California，1950：347.

[19] BJERRUN O J，HEEGAARD N H H.CRC Handbook of Immunoblotting of Proteins，Volume l，Technical Descriptions[M].Boca Raton，FL：CRC Press，1988：229-236.

[20] 張成崗，袁守軍，鄧美玉，等.一種對斑點和條帶信號進行半定量圖像分析的簡便方法[J].中國體視學與圖像分析，2001，6（3）：167-170.

[21] 李健，位蘭，薛幫群，等.環境雌激素的雄性生殖毒性作用及機制[J].畜牧與飼料科學，2011，32（3）：81-82.