碳源對固定化費氏丙酸菌生產(chǎn)丙酸的影響研究

揣玉多等

摘要 [目的]研究碳源對固定化費氏丙酸菌生產(chǎn)丙酸的影響。[方法]采用吸附-包埋結(jié)合法制備固定化費氏丙酸菌細胞，用于生產(chǎn)丙酸，研究了碳源（葡萄糖、乳酸鈉和蔗糖）及其濃度對固定化細胞生產(chǎn)丙酸的影響。[結(jié)果]最適宜的碳源為乳酸鈉，最適濃度為40 g/L，丙酸產(chǎn)量13.03 g/L。[結(jié)論]試驗考察了碳源對固定化費氏丙酸菌生產(chǎn)丙酸的影響，為費氏丙酸菌的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

關鍵詞 費氏丙酸菌；丙酸；碳源

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03191-02

Abstract [Objective] To study effects of carbon sources on propionic acid production by immobilized Propionibacterium freudenreichii. [Method] The cells of Propionibacterium freudenreichii were immobilized in adsorptionentrapping methods for the production of propionic acid. The effect of the carbon sources （glucose， sodium lactate， sucrose） and their concentration on propionic acid production were investigated. [Result] The experimental results showed that the sodium lactate was more suitable carbon source than glucose and sucrose. The yield of propionic acid fermented with immobilized Propionibacterium freudenreichii reached up to13.03 g/L with The optimal sodium lactate concentration of 40 g/L. [Conclusion] Effects of carbon sources on propionic acid production by immobilized Propionibacterium freudenreichii were investigated， which will provide reference for development and utilization of Propionibacterium freudenreichii.

Key words Propionibacterium freudenreichii； Propionic acid； Carbon sources

近10年來，我國丙酸的需求量猛增。在飼料加工，谷物防霉，食品防腐和農(nóng)藥醫(yī)藥方面均有巨大的潛在市場，因此我國丙酸行業(yè)的開發(fā)將有廣闊的前景[1-2]。目前，丙酸的工業(yè)化生產(chǎn)方法為化學合成法[3]，但是隨著全球環(huán)境保護意識和能源節(jié)約意識的增強，以及一些歐盟國家擔憂化學合成法生產(chǎn)的丙酸可能存在食品安全問題，近年來，越來越多人圍繞微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸進行了大量的研究工作[4-5]。筆者采用吸附-包埋結(jié)合法制備的固定化費氏丙酸菌細胞用于發(fā)酵生產(chǎn)丙酸，在對菌種選育和固定化方法研究的基礎上，參考陳玉梅[6]、Himmi EH[7]、Coral J[8]、Leaver FW[9]、Wang Z[10]等試驗結(jié)果，選取葡萄糖、乳酸鈉和蔗糖3種常用的單一碳源進行固定化費氏丙酸菌細胞發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的試驗研究，以期為費氏丙酸菌的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。費氏丙酸桿菌（P.freudeneichii）的突變株Pf 007，由天津科技大學工業(yè)微生物教育部重點實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基。活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸銨5 g/L，pH=7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸銨5 g/L，碳酸鈣3 g/L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 固定化菌體的制備。①菌懸液的制備。取丙酸菌發(fā)酵液200 ml放入離心杯中，于18 000 r/min離心10 min，去除清液，再加入生理鹽水搖勻，然后離心洗滌兩次。加入60 ml無菌水搖勻制成菌懸液。②包埋劑的制備。按3%∶3%的比例稱取一定量的聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（CA），加入15 ml去離子水加熱融化，攪拌至充分混合，封口，放置到滅菌鍋，于115 ℃下滅菌20 min。③交聯(lián)劑的制備。配成3%的氯化鈣溶液即為交聯(lián)劑。④固定化凝膠小球的成型。按5 ml菌懸液加入0.600 g麩皮的比例，向菌懸液中加入麩皮，混勻，然后將配好的包埋劑倒入上述混合液中，混勻，利用注射器吸取并滴入交聯(lián)劑中。⑤交聯(lián)。完成上述工作后，將該小球交聯(lián)24 h以保證其強度。交聯(lián)24 h后，用生理鹽水沖洗。然后轉(zhuǎn)到生理鹽水中，放到4 ℃冰箱保存。

1.2.2 不同碳源發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的方法。分別以20、40、60和80 g/L的葡萄糖、乳酸鈉和蔗糖為底物，經(jīng)過72 h的發(fā)酵，測丙酸產(chǎn)量，計算丙酸轉(zhuǎn)化率。計算公式為：丙酸轉(zhuǎn)化率（%）=丙酸產(chǎn)量/碳源濃度×100。

1.2.3 發(fā)酵條件。3%接種量，裝液量為250 ml磨口三角瓶裝液100 ml，發(fā)酵溫度30 ℃，靜置培養(yǎng)72 h。

1.2.4 丙酸菌代謝產(chǎn)物丙酸的分析方法[11]。

1.2.5 葡萄糖、乳酸和蔗糖的分析測定。使用SBA40生物傳感分析儀對發(fā)酵液中的葡萄糖、乳酸和蔗糖進行測定。取發(fā)酵液1 ml，10 000 r/min離心5 min，然后稀釋10倍，用微量注射器取上清液25 μl進樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的葡萄糖對丙酸菌發(fā)酵的影響 圖1表明，發(fā)酵8 h，丙酸的產(chǎn)生速度較快，丙酸產(chǎn)生速度分別為0.98、0.78、0.53和0.54 g/L·h。隨著時間的增加，較低的葡萄糖濃度產(chǎn)酸速度比高濃度的要快一些，逐漸趨于平緩，這是因為酸的產(chǎn)生抑制了丙酸菌的發(fā)酵[12]，同時可以看出葡萄糖（底物）濃度越高，對丙酸菌的抑制作用越強，底物的利用率越低。葡萄糖濃度為40 g/L時，丙酸產(chǎn)量為11.54 g/L，丙酸轉(zhuǎn)化率29%，是比較適合的底物濃度。

3 結(jié)論

試驗采用吸附-包埋結(jié)合法制備的固定化費氏丙酸菌細胞用于發(fā)酵生產(chǎn)丙酸，在對菌種選育和固定化方法研究（方法另文發(fā)表）的基礎上，參考陳玉梅[6]、Himmi EH[7]、Coral J[8]、Leaver FW[9]、Wang Z[10]等試驗結(jié)果，選取葡萄糖、乳酸鈉和蔗糖3種單一碳源進行固定化費氏丙酸菌細胞發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的研究。結(jié)果表明，與葡萄糖、蔗糖相比，40 g/L乳酸鈉的丙酸產(chǎn)量較高，達到13.03 g/L，底物利用率達到97%，丙酸轉(zhuǎn)化率達到33%。最適宜的碳源為乳酸鈉，最適濃度為40 g/L，丙酸產(chǎn)量13.03 g/L。因此確定以40 g/L乳酸鈉為碳源進行固定化費氏丙酸菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酸。

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