一株A型副雞嗜血桿菌的分離鑒定

李峰　苗立中　沈志強

摘 要：從山東省某蛋雞場發病雞群中分離到一株細菌，經培養特性觀察、生化試驗、V因子生長試驗、致病性試驗和PCR試驗，證實分離菌為一株致病性副雞嗜血桿菌，血清型鑒定該菌為A型。藥物敏感性試驗表明分離菌對頭孢噻肟、頭孢曲松、丁胺卡那霉素高度敏感，對硫酸新霉素、強力霉素中度敏感，對磺胺間甲氧嘧啶鈉、環丙沙星、慶大霉素耐藥。

關鍵詞：A型；副雞嗜血桿菌；傳染性鼻炎；分離鑒定近日，山東某養殖場一批140日齡左右的雞群出現面部單側或雙側腫脹，流鼻涕、打噴嚏癥狀，并且2d內產蛋率下降約10個百分點，場主即攜帶發病雞到我院獸醫診斷中心就診。經病原分離、生化試驗、V因子生長試驗、致病性試驗和PCR鑒定，確診為A型副雞嗜血桿菌感染，經藥敏試驗，選擇敏感藥物治療，較快控制了疫情。現將試驗情況報告如下。

1 材料

1.1 病料 3只發病雞，山東某養殖場提供。

1.2 試驗雞 10只30日齡非免疫健康雞，由山東綠都生物科技有限公司實驗動物中心提供。

1.3 培養基 雞鮮血瓊脂、雞血清肉湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養基，按文獻方法[1]自制。

1.4 標準副雞嗜血桿菌陽性血清 山東省濱州獸醫生物技術重點實驗室提供。

1.5 細菌微量生化反應管 購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.6 藥敏試驗紙片 購自北京天壇藥物技術開發公司。

1.7 PCR擴增引物 參照GenBank中副雞嗜血桿菌的基因序列，借助Primer5.0引物設計軟件設計1對引物。

A上游5-GCGGGACACGATGTGGCTAT-3，B下游5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3，由上海生工合成。

2 方法

2.1 細菌分離培養 將病雞處死，用棉拭子沾取眶下竇內容物，分別劃線接種于雞鮮血瓊脂、雞血清肉湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養基上，置5%的CO2培養箱，37℃培養16～24h后觀察，挑取單個可疑菌落接種到含血清的雞肉湯培養基中進行純培養，同時涂片，革蘭氏染色、鏡檢。

2.2 生化鑒定 將純化好的細菌劃線培養后，取單個菌落接種于生化反應管內，并在微量發酵管中分別加入0.2ml的雞血清和濃度為1%的輔酶I 0.2ml，用蠟封口，倒置于放有脫脂棉的平皿內，37℃厭氧罐中培養24～48h，觀察結果。

2.3 V因子生長試驗 用接種環蘸取新鮮的肉湯培養物，在無NAD的雞血清肉湯瓊脂上劃8～10條橫線，再用金黃色葡萄球菌劃一豎線，翻轉平板置37℃，5%CO2培養箱培養18～20h，觀察分離物是否出現衛星現象。

2.4 致病性試驗 將純培養的菌落接種于雞血清肉湯中培養24h，接種30日齡齡非免疫健康小公雞6只，每只雞各取0.2ml培養物進行眶下竇接種，同時滴鼻（1×108CFU/ml）；同時用生理鹽水接種4只試驗雞，0.2ml/只，作為對照組。分別隔離飼養觀察。對出現典型癥狀的雞，無菌采取眶下竇分泌物，進行本菌的回收培養。

2.5 PCR鑒定 以分離菌雞血清雞肉湯純培養物2m作為模板進行PCR鑒定。采用25反應體系（超純水17μl、10×PCR buffer 2.5μl、dNTP 2.0μl、A和B各1μl、模板1μl、rTap酶0.5μl）于95℃變性5min，25個循環（94℃1min，53.9℃1min，72℃2min）最后72℃延伸10min。1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

2.6 血清型鑒定 用常規凝集試驗方法，取純化菌株與A、B、C型副雞嗜血桿菌的標準陽性血清進行凝集試驗。

2.7 藥敏試驗 用紙片法進行，對分離菌用頭孢噻肟、頭孢曲松、丁胺卡那霉素、硫酸新霉素、強力霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、環丙沙星、慶大霉素共八種藥物在雞肉湯瓊脂平板上，按常規紙片法進行了藥敏試驗。

3 結果

3.1 細菌分離鑒定結果 無菌接種培養基24h后，在麥康凱瓊脂、鮮血瓊脂平板上，均無菌生長。在雞血清肉湯瓊脂上長出灰白色露滴狀、邊緣整齊、表面光滑、有輕度隆起、粘液狀、濕潤、有光澤、不透明、邊緣有虹彩的菌落。挑取菌落涂片，染色、鏡檢，為革蘭氏陰性球桿菌，單個、成對或多個堆積在一塊。

3.2 生化試驗結果 分離菌能夠發酵葡萄糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖，不發酵乳糖、菊糖、鼠李糖、山梨醇、和肌醇，過氧化氫酶反應陰性，硫化氫試驗陰性，吲哚試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性。

3.3 V-因子需求試驗結果 培養24h后觀察，在靠近金黃色葡萄球菌劃線處，該菌菌落生長密集，比較大，成半透明狀，遠離金黃色葡萄球菌處的菌落則生長稀少，也比較小，呈較典型的“衛星現象”。

3.4 致病性試驗結果 試驗雞接種后5d開始出現發病癥狀，到第7天流鼻液，不同程度的單側臉部和眼瞼腫脹，個別雞有呼吸困難。對照組雞正常。從人工感染發病雞的眶下竇的分泌物中均能分離到本菌。

3.5 PCR鑒定 分離菌DNA的提取由BioTeke基因組DNA提取試劑盒提取（按照試劑盒說明書提取），以DNA基因組為模板PCR擴增，獲得了939bp的目的陽性條帶（如圖1）。

3.6 血清型鑒定結果 分離菌能夠與A型雞副嗜血桿菌的標準陽性血清在3～5min內出現凝集現象，且與B、C型雞副嗜血桿菌的標準陽性血清無凝集發生。同時陽性對照和陰性對照均成立。

3.7 藥敏試驗結果 分離菌對頭孢噻肟、頭孢曲松、丁胺卡那霉素高度敏感，對硫酸新霉素、強力霉素中度敏感，對磺胺間甲氧嘧啶鈉、環丙沙星、慶大霉素耐藥。

4 小結與討論

4.1 根據臨床癥狀、細菌分離培養、生化試驗、V因子生長試驗、致病性試驗和PCR試驗及血清型鑒定，證明病原為A型副雞嗜血桿菌。通過藥敏試驗，選擇丁胺卡那霉素用于該場治療，在短時間內有效控制了疫情。

4.2 副雞嗜血桿菌主要導致傳染性鼻炎臨床癥狀主要特征為流鼻涕、打噴嚏、單側或雙側眼瞼水腫，并能導致產蛋雞產蛋量下降10%～40%不等，若與其他病毒性疾病并發，死亡率具增高趨勢[2]。

4.3 副雞嗜血桿菌的培養需要V因子，由于葡萄球菌具有產生V因子的特性。所以常利用與葡萄球菌同培養的方式，以是否產生“衛星現象”作為該菌鑒定的重要依據[3]。本試驗符合這一特性。

4.4 按Page的分型方法，副雞嗜血桿菌可分為A、B和C三個血清型，我國于1987年首次在北京分離到副雞嗜血桿菌[4]，目前A、B和C三個血清型已均有報道[5-7]。而目前我國批準使用疫苗多為A、C型二價疫苗，所以常見病例多是由于未正常免疫或者是由于新的血清型的出現導致免疫失敗引起的。因此，研制開發新的含三種血清型的疫苗是提高防控本病的有效手段。

參考文獻：

[1] 陳天壽.微生物培養基的制造與應用[M].第一版.北京：中國農業出版社.1995，239-240.

[2] B.W卡爾尼克.禽病學[M].第十版.北京：中國農業出版社.1999，218-234.

[3] 刁有祥. 禽病學.北京：中國農業科學技術出版社.2008，217-223.

[4] 馮文達.北京及傳染性鼻炎病原菌的分離鑒定[J].微生物學通報，1987，（5）：216～219.

[5] 苗得園，孫惠玲，陳曉峰，等.副雞嗜血桿菌的分離鑒定及我國雞傳染性鼻炎的流行狀況分析[J]. 中國預防獸醫學報，2006，28（4）：392-395.

[6] 張培君，苗得園，龔玉梅，等.B型雞副嗜血桿菌的分離鑒定[J].中國預防獸醫學報，2003，25（1）：56～58.

[7] 苗立中，沈志強，王艷，等.副雞禽桿菌河南株的分離及PCR鑒定[J].畜牧與獸醫，2010，2：66-68.