東營地區NDV和IBV分離株遺傳分析

陳申秒等

摘 要：對東營地區規模化肉雞養殖場近兩年送檢的病死雞進行分子檢測，確定NDV和IBV的發生率很高，針對具有典型特征的NDV和IBV分離株分別進行了F基因和S1基因的測定和分析，確定為腎型傳支和基因7型新城疫，通過與流行毒株和疫苗毒株的分析為以后該地區的防疫提供幫助。

關鍵字：NDV；IBV；進化分析

2012年初至2013年7月，本單位收到東營多個規模化肉雞場送檢的病死肉雞近1000例，經剖檢、分子生物學檢測﹑分離鑒定及測序分析，確診為腎性傳支IBV和基因7型NDV病毒的流行。將具有代表性的IBV分離株命名為DY717-IBV；NDV分離株命名為DY717-NDV，從分子學上對其進行了遺傳分析，希望為該地區傳染性支氣管炎和雞新城疫的防治提供幫助。

1 剖檢病變

腎臟腫大，尿酸鹽大量沉積，“花斑腎”十分典型，沿腎臟出現明顯的尿酸鹽沉積線，干酪物，氣管出血和支氣管出血（圖1、2、3）。

2 分子生物學檢測診斷

3 分離毒株DY717-IBV、DY717-NDV測序分析結果

將分離得到的DY717-IBV、DY717-NDV經分子生物學方法分別對IBV的S基因進行基因克隆，送至北京華大基因測序公司進行測序，將獲得的測序結果進行了比對分析。

3.1 DY717-IBV的S基因分析

DY717-IBV與本實驗室自行分離的IBV野毒株及保存的相關疫苗毒株，經RT-PCR擴增其S1基因，測序后與傳統的經典毒株共同進行基因和推導的氨基酸序列系統發育進化分析，其中H120，IBV-H52株，W491株，W93株均為疫苗毒株；LC株，IBX株，SC0901株（四川），zhejianghuzhou8株（浙江），Taiwan株（臺灣），SD10株，RZ株（日照）CAL99-07株，LNX株均為近些年國內流行毒株。DY717-IBV為東營分離株；以上毒株的S1基因序列均被本實驗室送往北京華大基因測序結果。

由圖5可知，DY717-IBV分離株與H120株，CH-LNX株，RZ株，浙江株，四川株等國內毒株的核苷酸序列同源性較高，都在96%～98.6%之間。江蘇分離株與M41株的同源性為77.8%，與491株的同源性為78.4%。

由圖6可知，S基因的裂解氨基酸序列分別為HRRRR、RRFRR、RRLRR；根據S1基因的序列和分子遺傳進化分析發現：HRRRR是中國IBV腎型毒株近年新出現的裂解位點。疫苗株M1與491株，CAL99株，臺灣株的裂解位點為RRF/LRR；H120株，LNX株，SD10株，浙江株的裂解位點均為HRRRR。東營肉雞DY717-IBV分離株的裂解位點同樣也為HRRRR，DY717-IBV分離株為典型的腎型毒株。

3.2 DY717-NDV的測序分析結果

新城疫是由雞副黏病毒引起的一種急性，高度接觸性傳染和致死性的傳染病，是嚴重危害養雞業發展的重要疫病之一。新城疫病毒囊膜上的融合蛋白基因（F基因）是決定毒力和免疫應答的主要因素，F基因裂解位點區的氨基酸組成是NDV致病力的分子基礎。NDV強毒株裂解區域氨基酸序列為112R-R-Q-K/R-R-F117，弱毒株的裂解區域氨基酸序列組成為112G-K/R-Q-G-R-L117。

基因2型參考毒株：LaSota，Clone 30，HB92 V4，XD-Shandong08均來自Genbank中已經證實的基因2型NDV弱毒株；基因7型參考毒株：SD09，SDWF02，SG-Liaoning2009，TianJin08均來自Genbank中已經證實的基因7型NDV強毒株；東營肉雞分離株：DY717-NDV。

圖7中，DY717-NDV與基因7型NDV強毒參考毒株的同源性在96.2%～99.8%之間，同源性較高。DY717-NDV分離株與LaSota，Clone 30，HB92 V4，XD-Shandong08等基因2型NDV弱毒參考毒株的核苷酸同源性在82.1%～82.7%之間，同源性相對較低。DY717毒株與LaSota，Clone 30等的疫苗毒株的同源性分別為82.5%和82.7%，也預示著二者與DY717毒株具有一定程度的交叉保護，免疫LaSota和Clone 30的雞群不能夠完全抵御DY717毒株的攻擊。

由圖8可知，分離株DY717-NDV和基因7型NDV強毒參考毒株SD09，SDWF02，SG-Liaoning2009，TianJin08等全部位于一個較大的共同的分支之上（圖8內上方黑框位置），這表明DY717-NDV為基因7型的毒株，毒力相對較強。

LaSota，Clone 30，HB92 V4，TYQ-Shanxi07，XD-

Shandong08等基因2型NDV弱毒參考毒株共同處于一個進化分支之上（圖8內下方黑框位置），與DY717-NDV以及基因7型NDV強毒參考毒株有著明顯的區別和界限。

由圖9可知，綜上所述，DY717-NDV與分離株SD09，SDWF02，SG-Liaoning2009，TianJin08均為基因7型NDV強毒毒株。這也表明當前ND的流行仍以基因7型為主。對不同基因型的NDV毒株進行同源性分析發現，不同基因型之間，其核苷酸同源性較低，這也表明我國當前許多雞群的免疫效果不佳或僅能部分保護，與NDV的基因7型流行有關。

4 小結

通過對IBV東營分離株S基因的分析，該地區分離株與國內毒株的核苷酸序列同源性較高，與M41株、491株的同源性相對較低；其S基因的裂解氨基酸序列為近年來新出現的腎型毒株的裂解位點，流行于該地區的毒株多為腎型傳支，且與部分疫苗毒株的同源性較低，正確篩選疫苗毒株具有很重要的臨床意義。

分離株DY717-NDV和基因7型NDV強毒參考毒株全部位于一個較大的共同的分支之上，確定DY717-NDV為基因7型的毒株，且毒力相對較強。對不同基因型的NDV毒株進行同源性分析發現，不同基因型之間，其核苷酸同源性較低，這也表明我國當前許多雞群的免疫效果不佳或僅能部分保護，可見基因7型新城疫在雞群特別是肉雞群規模化養殖中的危害較大，對此類毒株開展深層次的研究乃至疫苗的研發亟待進行。（編輯：郭遠）