微囊藻毒素的檢測方法及其展望

內(nèi)陸水體富營養(yǎng)化的加劇引起了藻類大量繁殖，形成日趨嚴(yán)重的水華污染。水華污染是淡水水體中危害最嚴(yán)重的因素之一，所產(chǎn)生的微囊藻毒素（Microcystins，MC）毒性較大，分布廣泛，具有穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，是目前發(fā)現(xiàn)的最強的肝臟腫瘤促進(jìn)劑之一。常規(guī)飲用水處理技術(shù)并不能有效地脫除水體中的微囊藻毒素，微囊藻毒素引起的野生動物、家禽和家畜等中毒或死亡的事件已有許多報道，并通過生態(tài)系統(tǒng)、食物鏈對人類造成潛在的威脅。由于MC-LR在微囊藻毒素中的毒性最大，并證實其有促腫瘤作用，所以目前關(guān)于飲用水中藻毒素的限值都是以MC-LR為代表的。上世紀(jì)九十年代世界衛(wèi)生組織（WHO） 在對飲用水質(zhì)量基準(zhǔn)的補充文件中規(guī)定微囊藻毒素- LR（游離的和與細(xì)胞結(jié)合的） 的基準(zhǔn)值為0.001mg/L，我國在2006年修訂并實施的《國家生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中已將MCYST-LR列為非常規(guī)監(jiān)測項目，確定執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為0.001mg/L。水體中藻毒素污染已成為一個全球性的環(huán)境問題而日益受到人們的關(guān)注。

1微囊藻毒素的特點

藻細(xì)胞破裂后會釋放出多種藻毒素。一般認(rèn)為它是由肽合成酶復(fù)合體合成的生物活性小肽，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)及其氨基酸的特殊結(jié)構(gòu)。影響微囊藻毒素合成的環(huán)境因子較多，主要的有光照、溫度、pH值和營養(yǎng)元素等。有研究結(jié)果表明藻毒素是初級代謝產(chǎn)物，其主要作用是通過鰲合使進(jìn)入藻體內(nèi)的重金屬離子減輕毒性和抑制其它水生植物并促進(jìn)其本身的生長。不同藻毒素的功能還有待深入研究。

2檢測方法

國內(nèi)在這方面的研究則相對集中在對MC的去除方法上，在檢測技術(shù)方面目前常用的檢測方法主要有生物毒理檢測法、化學(xué)分析法和生化分析法。

2.1生物毒理檢測法：生物毒理檢測法包括動物毒性法、細(xì)胞毒性法。動物毒性法是將純化的微囊藻毒素或水華藍(lán)藻中提取的藻毒素通過動物口服或注射來間接評價藻毒素的毒性的一種方法。根據(jù)動物的生理病變及半致死劑量（LD50）可初步確定藻毒素的毒性，這也是毒理評價的常用方法。除個別異構(gòu)體的LD50為200～250μg/kg外，多數(shù)微囊藻毒素的LD50為60～70 μg/kg。動物毒理檢測法操作簡單，但個體差別較大，并不能準(zhǔn)確的判定藻毒素類型及結(jié)構(gòu)。因此動物毒理檢測法通常只作為毒性檢測的最初篩選方法.另外還有利用毒素對細(xì)胞的毒性作用來檢測的方法是細(xì)胞毒性檢測技術(shù)。這種技術(shù)既可以對毒素定性分析還可以精確的定量。谷康定等用2步灌流法制備大鼠原代肝細(xì)胞，經(jīng)MC-LR處理后，數(shù)小時后細(xì)胞形態(tài)學(xué)即發(fā)生改變，其靈敏度可達(dá)μg/L級。但該技術(shù)操作繁瑣，基本上處于初步研究階段，目前較難大范圍推廣應(yīng)用。

2.2化學(xué)分析法：高效液相色譜是目前應(yīng)用最廣泛的方法，具有較高的靈敏度和精密度，依據(jù)保留時間定性，一次可以測定多種藻毒素。高效液相色譜可以分離純化、定性或定量檢測微囊藻毒素。一般是先將樣品通過固相萃取吸附富集，溶劑淋洗后洗脫，用于定性、定量分析。另外可采用色質(zhì)聯(lián)用或與核磁共振聯(lián)用技術(shù)確定藻毒素的分子式和結(jié)構(gòu)。對于流動相，一般采用乙腈/水或甲醇/水體系的不同濃度梯度淋洗，在水相中加入一定比例的三氟乙酸或采用酸性的磷酸鹽緩沖溶液以保持酸性（pH約2.5），用C18固相萃取柱對藻毒素進(jìn)行分離。藻毒素的種類繁多，很多情況下需要測定水體中總藻毒素的濃度。藻毒素均含有側(cè)鏈ADDA基團，而藻毒素的毒性與側(cè)鏈ADDA基團密切相關(guān)，ADDA基團的最大吸收峰在238nm處，所以對MC的化學(xué)檢測，常采用HPLC/UV法。

2.3生化分析法：生化分析法有酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）和蛋白磷酸酶抑制法（Protein phosphotase inhibition assay， PPIA），由于具有靈敏、快速、適用于分析大批樣品等特點，顯示出良好的發(fā)展趨勢。ELISA是用制備的藻毒素多克隆抗體測定藻毒素總量。日本MBC和美國等公司制備了單克隆抗體的試劑盒，可以檢測到0.05～1.0 μg/L的藻毒素濃度。但因不同類型藻毒素的結(jié)構(gòu)非常相似，因此，也不能識別出藻毒素的特定類型，只能測定藻毒素的總量。PPIA 則是利用微囊藻毒素對熒光物質(zhì)蛋白磷酸酶PP1和PP2A活性專一性的抑制效應(yīng)進(jìn)行定量分析，檢測限可達(dá)0.012～0.177μg/L 。蛋白磷酸酶抑制法常與放射性的32P或熒光劑結(jié)合使用，增加了測定操作與設(shè)備，而且藻細(xì)胞內(nèi)源磷酸酶的存在會增大測定誤差。另外和酶聯(lián)免疫吸附法一樣，蛋白磷酸酶抑制法測定的也是藻毒素的總量。

3展望

如何控制微囊藻毒素對飲用水的污染，如何保證飲用水的安全已成為世界各國共同面臨的一個環(huán)境科學(xué)難題。首先應(yīng)研究建立完善的凈水工藝，去除細(xì)胞內(nèi)藻毒素和釋放入水中的溶解性藻毒素。增強微囊藻毒素在飲用水深度處理工藝的研究。研究各種去除方法如光催化氧化、紫外-臭氧氧化、化學(xué)藥劑氧化、膜濾、生物活性炭等，雖然目前的研究成果表明，物理方法，化學(xué)方法，生物方法等都能對藻毒素進(jìn)行部分去除，但在實際應(yīng)用中各自存在著一定的局限性，這些方法有待進(jìn)一步的開發(fā)和完善。其次應(yīng)建立完善的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法及前處理方法，能夠快速，高效，準(zhǔn)確，靈敏的對微囊藻毒素進(jìn)行富集純化和檢測。