研究藥用藻類中多糖對雙歧桿菌的促增殖作用

摘要：目的：探索藻類中藥中多糖對雙歧桿菌的促增殖作用。方法：在恒溫條件下，以時間和多糖濃度為影響因素，了解不同藻類中多糖對雙歧桿菌的促增殖作用，對其量效關系進行分析。結果：實驗結果表明在37℃多糖濃度在0到2%范圍內，雙歧桿菌數(shù)隨多糖濃度的增加而上升；多糖濃度繼續(xù)升高，則反而下降。結論：海藻中多糖在一定濃度下能很好地促雙歧桿菌生長。

關鍵詞：藻類中多糖；雙歧桿菌；促增殖作用

The research of medicinal algae polysaccharide on the proliferation of bifidobacterium

Xu PingWu YunLi YingaiLi Linzhuan

Abstract：Objective：to explore the algae polysaccharide in traditional Chinese medicine （TCM） on the proliferation of bifidobacterium. Methods： under the condition of constant temperature， time and concentration of polysaccharide as the influencing factors， and to understand different algae polysaccharide in effect on promoting proliferation of bifidobacteria， analyzes its concentration-response relationship. Results： the experimental results show that in 37 ℃ polysaccharide concentration at zero to 2% range， number of bifidobacteria rise with the increase of the concentration of polysaccharide； The polysaccharide concentrations continue to rise， the worse instead. Conclusion ： the contents of polysaccharide in algae under certain concentration can promote the growth of bifidobacteria.

Key words：The contents of polysaccharide in algae； Bifidobacterium； Its effect on promoting proliferation

【中圖分類號】R561【文獻標識碼】A【文章編號】1002-3763（2014）03-0001-03

1前言

藻類是低等的海洋隱花類植物，包括紫菜、海帶、羊棲菜等。其含有多種生命物質，尤其是海藻多糖有調節(jié)細胞分裂與分化、調節(jié)細胞生長和衰老及維持生命有機體的正常代謝的功效活性。能夠起到抗病毒、抗腫瘤、抗輻射、抗突變、抗氧化、增強免疫機能的效果。隨著多糖研究的進展，藻類以其很好的藥用價值而得到廣泛和深入的研究。

雙歧桿菌做為人體腸道內占絕對優(yōu)勢，對人體具有許多重要生理功能的有益菌。隨著微生態(tài)學的迅猛發(fā)展，雙歧桿菌的臨床保健作用逐漸被人們認識和接受，并對其進行了更深入的研究。

研究藥用海藻中多糖對雙歧桿菌的促增殖作用，驗證海藻中多糖對雙歧桿菌有顯著的增殖作用，可作為雙歧因子進一步開發(fā)研制，促進微生態(tài)學發(fā)展。而我們的日常膳食結構中盡可能多調配這類食物，以促進腸道內雙歧桿菌的生長，調節(jié)腸道菌群結構，使雙歧桿菌等有益菌群占優(yōu)勢。

雙歧桿菌是人體的生理細菌，為革蘭氏陽性細菌，無芽孢，不運動，嚴格厭氧，形態(tài)多變，不同種或同種不同菌齡，不同生長環(huán)境而呈現(xiàn)彎曲桿狀L或Y形等多種形態(tài)而得名，是人體腸道內數(shù)量最多餓一種菌。終生存在于人體與人的健康息息相關。

人的生理、免疫、營養(yǎng)、消化、抗腫瘤、抗衰老、藥物效能等都離不開人體自身攜帶的微生物群人體腸道內的雙歧桿菌具有有病治病，無病防病和保健的作用，它能形成生理屏障，阻止致病菌的定植和入侵，保護宿主免受致病菌侵害。能改善蛋白質代謝，提供多種B族維生素，能促進鈣鐵吸收。還能提高免疫力，增強抗腫瘤等多種作用。雙歧桿菌的不足意味著人體發(fā)生健康危機，需要及時補充。

隨著微生態(tài)理論體系的建立，使雙歧桿菌的臨床保健作用逐漸被人們認識和接受。現(xiàn)國內雙歧桿菌微生態(tài)調節(jié)劑所用菌的生產培養(yǎng)原料較貴，如能選擇合適劑量的海藻多糖直接調節(jié)人體腸道菌，增殖體內雙歧桿菌則能有較廣的發(fā)展前景。

本實驗中的海藻多糖為雙歧因子。能促進雙歧桿菌增殖所必需的無毒物質稱為雙歧因子，雙歧因子有的是含氮多糖或寡糖，有的是粘蛋白或酶類，有的是肽類或核酸成分其來源充足，分布廣泛。

2海藻多糖促雙歧桿菌生長實驗

2.1實驗材料

（1）樣品

羊棲菜多糖：利用乙醇沉淀法從羊棲菜中提取。

海帶多糖：利用乙醇沉淀法從海帶中提取。

海藻： 為馬尾藻科植物海蒿子或羊棲菜的藻體。咸寒，歸肝腎經(jīng)，有消痰軟堅，利水消腫之作用。《本草綱目》中記載：海藻，現(xiàn)咸能潤下，寒能泄熱引水，故能消癭瘤，結核之堅聚，而除浮腫、腳氣、痰氣之濕熱，使邪氣自小便出也。

昆布： 為海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布的葉狀體。咸寒，歸肝腎經(jīng)，有消痰軟堅，利水消腫之作用。《別錄》記載昆布，主十二種水腫，癭瘤聚結氣。

本實驗中將用羊棲菜和海帶

羊棲菜[Sargassum fusiforme （Harv.） Setch]：藻體黃褐色，肥厚多汁，高15～40cm。固著器為是北太平洋西部特有的暖溫帶植物，屬褐藻類馬尾藻科。是一種營養(yǎng)豐富的藻類，干品每百克含蛋白質10.6克，糖類47克，灰分18.3克，脂肪1.3克，鈣1400毫克，磷100毫克，鉀4400毫克，鐵5.5毫克，胡蘿卜素550毫克；還有多種維生素和微量元素。

海帶[Laminaria japonica Aresch]屬褐藻門海帶科，是一種大型食用海藻，有豐富的營養(yǎng)。每100克海帶中含有蛋白質8克， 甘露醇14克，鉀4.36克、鐵150毫克，超過菠菜，油菜幾倍至幾十倍。更為突出的是，海帶富含微量元素碘，每100克海帶含碘高達24000微克。

多糖提取工藝

取海藻置于托盤放入恒溫培養(yǎng)箱低溫烘干，用電磨機打碎，使之成粉末狀。用天平稱取海藻粉50g放入500ml錐形瓶中加蒸餾水250ml放置于95℃水浴鍋中，并隔10min晃一次，4h后取出，冷卻到室溫。離心取上清液，在離心管中加無水乙醇，得到沉淀再次離心，取沉淀（多糖），用蒸餾水沖洗數(shù)遍，于37度烘箱中烘干所得沉淀為粗多糖。

（2）培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基：

蛋白胨10g、肉浸膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20 g、吐溫80 1ml、K2HPO42g、醋酸鈉5g、檸檬酸銨2g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g、蒸餾水1000ml。pH值6.4。

20%肉湯：蛋白胨1g、肉浸膏1g、蒸餾水1000ml。pH值6.4。

（3）菌株：取自麗珠腸樂膠囊（由雙歧桿菌制成的干粉膠囊），珠海麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司，批號20030404。

（4）實驗儀器

Nbox Jar 7.0L，法國生物梅里埃公司

S.C.303型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)與試劑

厭氧培養(yǎng)盒GE箱，嘉興新睦電器廠

除氧劑，法國生物梅里埃公司

LD4-2高速離心機，北京醫(yī)用離心機廠

754型紫外可見分光光度計，上海第三分析儀器廠

TG328B電光分析天平

THZ-82型恒溫振蕩器，江蘇太倉醫(yī)療器械廠

2.2實驗方法與結果

菌液與溶液制備：

菌液制備：無菌條件下，從麗珠腸樂膠囊中取出內容物，溶解于10ml濃度為0.9%的無菌生理鹽水，攪拌均勻后用接種針蘸取少許溶液，涂布于無菌MRS固體培養(yǎng)基平板上，37℃下，于厭氧培養(yǎng)盒培養(yǎng)3d。再從平板中挑取色澤淡黃、圓滑突起的單菌落，接入40ml MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)2d。取少量培養(yǎng)液，測得菌液濃度為2.7×108個/ml。使用前稀釋至1.0×108個/ml備用。

多糖溶液制備：利用蒽酮硫酸法測得醇沉淀中多糖含量：羊棲菜：25.2%；海帶：24.7%；將2種粗多糖分別配制成一定濃度的溶液，并按實驗需要稀釋為8.0%、4.0%、2.0%、1.0%、0.5%的水溶液，每管各10ml，分別加入濃度為20%的肉湯培養(yǎng)基10ml混勻，同時制備作為對照的10%肉湯，115℃濕熱滅菌15min后備用。

附. 蒽酮硫酸法測定多糖含量

原理：糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產生有色物質，反應后溶液呈藍綠色，于620nm處有最大吸收，顯色與多糖含量呈線性關系。

標準曲線的制作：分別取0.1g/L的葡聚糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80ml，用蒸餾水補到1.00ml；分別加入4.00ml蒽酮試劑，迅速浸入冰水浴中冷卻，各管加完一起進入沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準確煮沸10分鐘取出，用自來水冷卻，室溫放置10分鐘左右，于620nm比色。以同樣處理的重蒸餾水為空白，進行比色。以光密度（OD值）為縱坐標，糖的含量微克數(shù)為橫坐標，得標準曲線。

樣品含量測定：取相當于糖濃度50μg/ml左右的樣品溶液1.00ml，加入蒽酮試劑，同標準曲線制作之操作，比色測定。根據(jù)標準曲線和樣品濃度計算含量。

標準曲線的制作

曲線Y=A+BX得：A=-4.89×10-3B=6.71×10-3r=0.998

依數(shù)據(jù)繪曲線

Y=0.00671-0.00489X；r=0.998

用分析天平取海帶多糖0.1213g，溶于100ml蒸餾水中，取1ml進行吸光度測定。得吸光度：0.153，代入標準曲線得多糖29.9ug海帶提取物含多糖%=0.0299×1000/121.3×100%=24.7%

用分析天平取羊棲菜多糖0.2008g，溶于100ml蒸餾水中，取1ml進行吸光度測定。得吸光度：0.254，代入標準曲線得多糖50.6ug

羊棲菜提取物含多糖%=0.0506×1000/200.8×100%=25.2%

3促雙歧桿菌生長實驗

3.1時間因素：

取3組濃度為2.0%、1.0%的多糖溶液管與作為對照的10%的肉湯液體管各10ml，加入濃度為107個/ml的雙歧桿菌菌液各0.1ml，37℃厭氧培養(yǎng)。12h、24h、48h后，分別取樣用無菌生理鹽水稀釋，接種于MRS瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)4d，計算出每ml培養(yǎng)液中所含的活菌數(shù)。結果見表1。以雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)為縱坐標，時間為橫坐標，繪得圖1。

3.2濃度因素：

根據(jù)表1選擇最佳的多糖溶液培養(yǎng)時間24h。取兩組海藻多糖濃度為4.0%、2.0%、1.0%、0.5%、的多糖肉湯溶液管以及作為對照的10%肉湯管各9ml，分別加入濃度為106個/ml的雙歧桿菌菌液1ml，37℃厭氧培養(yǎng)24h，取樣用無菌生理鹽水稀釋后，接種于MRS瓊脂平板上，37℃厭氧培養(yǎng)4d，計算出每ml培養(yǎng)液中所含的活菌數(shù)。表2即為各濃度多糖培養(yǎng)液中雙歧桿菌的活菌數(shù)。將實驗結果換算成以10為底的對數(shù)值，進行統(tǒng)計比較，結果見表3。以雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)為縱坐標，多糖濃度為橫坐標，繪得圖2。

從表2可以看到，在試驗濃度下，各類海藻多糖對雙歧桿菌均有顯著的促生長作用。加入不同濃度多糖的各試管雙歧桿菌活菌數(shù)明顯高于對照組（P<0.05）

圖2顯示，多糖在0.5%～2.0%的范圍內，隨著濃度的增加，雙歧桿菌的活菌數(shù)呈上升趨勢，增長較為平緩，當濃度為2.0%的時候到達頂峰。說明在這一范圍內，羊棲菜多糖對雙歧桿菌的促生長作用與濃度呈正相關。然而在多糖濃度為4.0%的時候，雙歧桿菌活菌數(shù)出現(xiàn)下降。推測其原因，隨著多糖濃度的增高，培養(yǎng)液滲透壓也逐漸增大，使環(huán)境變得不利于雙歧桿菌生長，從而造成菌數(shù)減少。因此，本實驗結果顯示適合雙歧桿菌生長的羊棲菜多糖濃度在2.0%～4.0%之間。在不同的海藻多糖之間，雙歧桿菌的活菌數(shù)也存在著差異，海帶多糖的促生長作用較強，而羊棲菜促生長則相對較弱，與前者相差一倍。在2.0%多糖濃度下37℃培養(yǎng)24h，各類海藻多糖的促生長作用最強，海帶多糖培養(yǎng)液可以使雙歧桿菌的活菌數(shù)達到原來的6倍。

實驗結果表明海藻多糖是非常優(yōu)良的雙歧桿菌促生長因子，能有效增加腸道內的雙歧桿菌數(shù)量。在服用海藻多糖時應控制好多糖的用量或者采用緩釋技術，使得多糖在一個合適的濃度到達腸道，并保持一定的時間，對雙歧桿菌的生長起到促進作用，促進雙歧桿菌在腸道內的增殖和定植，優(yōu)化腸道的結構，維護機體的生態(tài)平衡，達到最佳的保健功效。根據(jù)表1，雙歧桿菌在厭氧條件下37℃培養(yǎng)24h，活菌數(shù)達到高峰，此時是獲得雙歧桿菌最高生物量的最佳時間，為雙歧桿菌為主的微生態(tài)活菌制劑生產提供了有用的條件參數(shù)。

本實驗采用了10%肉湯培養(yǎng)基為基質，使各種營養(yǎng)成分降低到僅能維持備試菌生長的濃度，目的是減少營養(yǎng)成分的影響，更能準確反應添加各類多糖的促進效果。目前增殖腸道內雙歧桿菌有兩種方法，一是通過攝取含雙歧桿菌的食物，補充雙歧桿菌的不足。二是服用促雙歧桿菌生長的雙歧因子，直接扶持、促進腸道中原雙歧桿菌的生長、繁殖，優(yōu)化腸道菌群結構，起調節(jié)腸道菌群的作用。但前者由于在儲存過程中活菌數(shù)不穩(wěn)定而影響了治療效果。本研究證實，海藻多糖是一種新的天然雙歧因子，它對雙歧桿菌促生長實驗為海藻類中藥的營養(yǎng)保健價值提供了科學的實驗依據(jù)，也提示我們正確利用野生植物資源。如把海藻這類資源豐富的野生植物改造成營養(yǎng)保健食品，前景是非常廣闊的。

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