聯(lián)合碳化公司UCARSAN 4256消毒劑抗禽喉氣管炎病毒及雞馬立克氏病毒效果測(cè)試

摘 要：本研究參照美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（EPA）關(guān)于消毒劑在干燥的非生物體表面的抗病毒效果測(cè)評(píng)方法，評(píng)定聯(lián)合碳化公司UCAESAN 4256消毒劑對(duì)禽喉氣管炎病毒及雞馬立克氏病毒的殺毒效力。

關(guān)鍵詞：禽喉氣管炎病毒；馬立克氏病毒；抗病毒效果；評(píng)測(cè)；UCARSAN 4256消毒劑

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

本實(shí)驗(yàn)旨在測(cè)評(píng)聯(lián)合碳化公司UCARSAN 4256消毒劑的抗禽喉氣管炎病毒和雞馬立克病毒的效力。其方法是用稀釋的消毒劑產(chǎn)品液對(duì)有病毒附著的污染物體硬表面消毒。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M使用并遵照美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（EPA）指南，按照EPA實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范（美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)匯編第40章第160節(jié)）進(jìn)行操作。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 病毒

禽喉氣管炎病毒來(lái)自位于美國(guó)斯托斯巴克斯特路67號(hào)的斯帕法斯公司（SPAFAS）。

馬立克氏病毒（ATCC VR-2175）來(lái)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(kù)。

2.2病毒培養(yǎng)細(xì)胞系

雞胚腎（Chicken Embryo Kidney，CEK）細(xì)胞系。

次代雞胚成纖維細(xì)胞（Secondary chicken Embryo Fibroblasts，CEF）。

2.3 活性成分

測(cè)試產(chǎn)品中的活性成分為戊二醛。

2.4 中和劑

試驗(yàn)用中和劑：加熱滅活的胎牛血清。

2.5 接觸時(shí)間

病毒與測(cè)試產(chǎn)品的接觸時(shí)間5 min。

2.6 接觸溫度

接觸溫度20 ℃±2 ℃。

2.7 測(cè)試用試劑

磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）。

Eagle極限必需培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)基。

基本Eagle培養(yǎng)基添加5 %胎牛血清（次代雞胚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基）。

基本Eagle培養(yǎng)基添加8 %胎牛血清（雞胚腎細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基）。

基本Eagle培養(yǎng)基添加2.5 %胎牛血清（次代雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚腎維持培養(yǎng)基）。

1 200 mg/kg AOAC合成硬水。

2.8 測(cè)試條件

取2份測(cè)試消毒劑UCARSAN 4256消毒劑，用其滅活在玻璃培養(yǎng)皿表面已干燥的攻毒用病毒。在接觸一定時(shí)間后，從培養(yǎng)皿表面刮取消毒劑-病毒混合液，收集、中和和培養(yǎng)，以確定活病毒。

2.9 實(shí)驗(yàn)材料

2.9.1攻毒病毒、宿主細(xì)胞系和培養(yǎng)基

2.9.2 補(bǔ)充培養(yǎng)基和試劑

a.磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）。

b.中和劑（加熱滅活的胎牛血清）。

2.9.3 實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和配備

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 病毒

試驗(yàn)所用病毒母液購(gòu)自位于美國(guó)馬里蘭州羅克維爾的美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC）或美國(guó)斯托斯巴克斯特路67號(hào)的斯帕法斯公司（SPAFAS），在美國(guó)MicrobioTest公司培育。病毒培養(yǎng)基在滴定和冷凍后用液氮貯藏。

3.2 載體制備

皮氏玻璃培養(yǎng)皿置于180 ℃下干熱滅菌2 h，隨后在室溫下冷卻、貯藏備用。

3.3 測(cè)試材料制備

測(cè)試消毒劑按照UCARSAN 4256消毒劑標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行制備。

3.4 測(cè)試

含有5 %有機(jī)土的冷凍病毒接種物在測(cè)試當(dāng)天解凍（也可使用新鮮培養(yǎng)基）。每份接種物各取其中一小份噴灑在3個(gè)3×2平方英寸的無(wú)菌皮氏培養(yǎng)皿表面（60-mm），隨后在室溫下放置20～40 min以使其干燥。干燥后的接種物按照試驗(yàn)發(fā)起人提出的要求或標(biāo)簽說(shuō)明加入消毒劑。培養(yǎng)板置于（20±1）℃環(huán)境中，放置時(shí)間由試驗(yàn)發(fā)起人確定。每份培養(yǎng)板進(jìn)行相同處理。

接觸5 min后，接種物/消毒劑混合的用細(xì)胞刮棒從培養(yǎng)皿的表面刮下，集中后進(jìn)行中和。

收集洗出液，用合適的細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋培養(yǎng)基進(jìn)行10倍的倍比稀釋。

3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

特選的稀釋液加入單層宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中（每份稀釋液設(shè)4個(gè)孔），隨后在（37±2） ℃和CO2含量 （5±1） %的環(huán)境下培養(yǎng)至病毒吸收（病毒懸垂）為止。

病毒吸收后，去掉該稀釋液。該單層細(xì)胞用磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）沖脫，隨后用細(xì)胞培養(yǎng)維持液再次培養(yǎng)。該培養(yǎng)基按照上述方式孵育，并在特定時(shí)間內(nèi)觀察病毒特異性細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathogenic Effect，CPE）。不會(huì)產(chǎn)生CPE的病毒將用使用人“O”型血、雞和/或豚鼠紅細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞吸附/紅血球凝聚分析法進(jìn)行評(píng)估，記錄觀察結(jié)果。

3.6 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組

3.6.1 每種病毒將在測(cè)試的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行滴定，以確定病毒傳染性。

3.6.2中和劑效力對(duì)照滴定將利用測(cè)試化合物-中和劑-病毒混合液進(jìn)行。滴定結(jié)果將與PBS-病毒的對(duì)照混合液滴定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。這將證明該中和反應(yīng)方法的效力。此步驟可在測(cè)試前進(jìn)行。

3.6.3 細(xì)胞毒性對(duì)照滴定將利用測(cè)試材料-中和劑混合液進(jìn)行，以檢測(cè)添加宿主單層細(xì)胞的檢測(cè)材料的細(xì)胞毒性。此步驟可在測(cè)試前進(jìn)行。

3.6.4 用無(wú)菌玻璃棒把病毒接種物涂在滅菌的皮氏玻璃培養(yǎng)皿表面，在室溫下放置30～60 min，使其自然干燥。干燥后加入2 mL PBS。該培養(yǎng)板采用與測(cè)試培養(yǎng)板相同的條件進(jìn)行孵育。該混合物從培養(yǎng)皿的表面刮下按早先介紹的方法進(jìn)行中和和滴定。此對(duì)照將證實(shí)在干燥后該病毒的感染性和可恢復(fù)的滴度（PBS培養(yǎng)板分離對(duì)照）。

3.7 計(jì)算方法

每一個(gè)測(cè)試組和對(duì)照組的平均CCID50/ mL值將通過(guò)Reed-Muench法，利用稀釋培養(yǎng)板進(jìn)行測(cè)定。

4 產(chǎn)品評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)環(huán)境保護(hù)局（EPA）的規(guī)定，如果所有稀釋液中的病毒完全滅活得到證明，該檢測(cè)化合物將通過(guò)檢測(cè)。如果細(xì)胞毒性明顯存在，病毒滴度下降3log10后必須被證實(shí)低于細(xì)胞毒性水平。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表4、5）

6 結(jié)論

聯(lián)合碳化公司UCARSAN 4256消毒劑在測(cè)試條件下，能有效殺滅禽喉氣管炎病毒和抗馬立克氏病毒。□□