豬流行性腹瀉病毒血清學監測和監視方法酶聯免疫吸附測定（ELISA）的開發與驗證

摘 要：豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDv）是冠狀病毒屬的成員之一，會引起哺乳仔豬急性發作嚴重的腹瀉和嘔吐，從而導致其大批死亡。PEDv最初發現于歐洲，現今已傳播到亞洲。其在美國的首次出現時間為2013年5月，并且至2013年7月中旬，15個州確定存在PEDv。因此，美國急需快速、高通量的診斷檢測方法，以進行血清學監測和監視。我們旨在設計可供診斷室使用的PEDv的ELISA測定分析方法，以檢測豬血清、口液和糞便中PEDv抗體。研究人員已完成了美國多個PEDv分離株的病毒顆粒（N）和纖突蛋白（spike protein）1區（S1）和2區（S2）的測序，發現它們的同源性在99 %以上。因此，任意分離株的重組蛋白都可以代表美國的PEDv分離株，且在酶聯免疫吸附測定中應該能產生交叉反應。為了凈化PEDv蛋白，筆者設計了PCR引物，以擴增N、S1和S2。隨后，擴增的基因克隆到pET-25b和pMAL-p5X載體中，以進行細菌表達。兩種載體將用于提高獲得大量高純度蛋白質的可能性。6X-his標簽用于金屬親合蛋白（pET-25b）的純化，而麥芽糖結合蛋白融合通過淀粉色譜分析法用于蛋白質純化（pMAL-p5X）。純合蛋白一旦獲得，將要開發的直接ELISA法用于檢測豬血清中PEDv抗體。血清檢測中獲得最佳ELISA結果的蛋白或蛋白融合物將進一步優化，以用于糞便和口液樣本中病毒抗體的檢測。

關鍵詞：豬腹瀉；ELISA；血清學；檢測；監視

中圖分類號：S855 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）01-0007-02

1 緒論

豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDv）是冠狀病毒屬的成員之一，會引起哺乳仔豬和生長豬急性爆發嚴重的腹瀉和嘔吐，并會引發乳豬大批死亡。1971年，PEDv在歐洲被首次發現，1982年成為亞洲的地方病。2013年5月，美國證實存在此病毒。由于病毒的出現，美國養豬業急需快速、高通量的診斷測試方法，以進行病毒的血清學檢測和監視。為了達到這一目標，筆者設計PEDv的ELISA方法，以檢測豬血清中是否存在抗PEDv的抗體。

2 實驗方法

2.1 PCR引物設計，以擴增病毒粒子（N）和纖突蛋白1區（S1）和2區（S2）。

2.2 從受感染豬的糞便中提取PEDv核糖核酸（PEDv RNA），合成cDNA，并利用PCR進行擴增。

2.3 PCR產物克隆到兩個質粒載體（pET-25b和pMAL-p5X）中。

2.4 重組質粒轉染到大腸桿菌細胞中，以誘導蛋白質的表達。

2.5 表達的蛋白質用6-his標記進行純化，并利用金屬親合色譜法（pET-25b），或麥芽糖結合蛋白融合法和淀粉親合色譜法（pMAL-p5x）進行固定。

2.6 回收的蛋白經純化和濃縮后，用凝膠電泳和分光光度技術進行確認。

2.7 純化蛋白質用于開發直接競爭ELISA分析方法，以進行抗PEDv抗體的檢測。

3 試驗結果

4 結論

⑴ 冠狀病毒的病毒顆粒和纖突蛋白質具有高度免疫原性，早先用于篩選豬血清，以尋找接觸和前先感染冠狀病毒，包括PEDv的血清學證據（Knuchel等，1992）。

⑵ 我們已成功把S2基因克隆進入載體pMAL-p5X中，蛋白質表達正在進行之中。

⑶ 目前，S1和N基因已能夠進行克隆。

⑷ PEDv纖突蛋白S1區包括中和抗原表位。因此，我們預計此重組蛋白對評估中和和交叉中和活性非常有用。

⑸ ELISA的開發將加快美國豬群PEDv感染狀態的篩選和監測，并預測有助于控制和殺滅PEDV 。原題名：Development and validation of ELISA testing for serological monitoring and surveillance of porcine epidemic diarrhea virus（英文）

原作者：B. Wier，C. M. T. Dvorak和M. P. Murtagugh（明尼蘇達大學獸醫和生物醫學系）