熒光定量RT-PCR在流感病毒檢測上的應用研究

摘要：目的：探討實時熒光定量RT-PCR在流行性感冒檢測上的臨床診斷意義。方法：收集阿壩州人民醫院臨床就診及住院病人流感樣病例標本，應用實時熒光RT-PCR檢測流感病毒核酸，陽性標本用狗腎傳代細胞（MDCK）培養、分離流感病毒，比較兩種檢測方法的靈敏度。結果：在613份標本中，實時熒光RT-PCR檢測陽性160份，陽性率為26.1%；MDCK細胞培養法分離流感病毒82株，陽性率為13.4%，兩者的陽性率差異有統計學意義。結論：實時熒光RT-PCR可以作為一種快速有效的流感病毒核酸檢測法，且操作方便，特異性強，靈活度高，可以廣泛適用于公共衛生應急疫情的實驗室快速診斷流感；而細胞培養法作為流感病原學監測的基礎，主要用于核實暴發疫情的實驗室診斷，對病毒進行抗原性和基因特性的分析。

Abstract：Objective：To investigate the clinical diagnostic significance of real time fluorescence quantitative RT-PCR in detection of influenza.Methods： to collect People’s Hospital of Aba Prefecture clinical treatment and hospitalization of influenza like patients specimens， the application of real-time fluorescent RT-PCR for detection of influenza virus nucleic acid， positive samples with Madin Darby canine kidney cells （MDCK） culture， isolation of influenza virus， to compare the sensitivity of two kinds of detection methods.Results： among the 613 specimens， 160 were positive by real-time fluorescent RT-PCR detection， the positive rate was 26.1%； MDCK cell culture method for the separation of 82 influenza virus strains， the positive rate was 13.4%， the difference was statistically significant positive rate between the two.Conclusion： the real time fluorescence RT-PCR can be used as a kind of influenza virus nucleic acid detection method is fast and effective， and has the advantages of convenient operation， strong specificity， high sensitivity， rapid diagnosis of influenza can be widely used in public health emergency epidemic laboratory；The cell culture method as the influenza monitoring etiology based， mainly used for laboratory diagnosis was verified outbreak， analysis of the antigenic and genetic characteristics of the virus。

關鍵字：實時熒光RT-PCR；流感病毒；細胞培養；

【中圖分類號】R511 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602（2014）10-0012-01

流感就是流行性感冒，它的臨床癥狀跟普通的感冒癥狀相似，最終需要通過實驗室方法來進行確診，在實驗室的診斷中，最直接的方法就是采集患者的咽拭字，狗腎臟傳代細胞（MDCK）進行病毒的分離、定型來進行判斷[1]。但是過去傳統的方法比較消耗時間和力氣，而目前常用流感病毒治療藥物的最佳使用時間是在2天以內，尤其是對暴發疫情的處理，診斷更是要越快越好，所以開展流感病毒的快速診斷是非常有必要的。

實時熒光定量PCR是在PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，是由美國的Applied Biosystems公司在1996年提出來的。該技術方法實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且還具有特異性強、能有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點[2]。目前在實驗室均得到廣泛應用。熒光定量PCR法是在PCR反應中除加入型、亞型特異物外，同時加入標記熒光的相應型、亞型特異核苷酸片段作為探針，探針雜交溫度比PCR反應中復性溫度高5℃，使得它與PCR產無語雜交，然后利用Taq酶內源性5’-3’核酸酶活性，并將未雜交的熒光探針降解，加入淬滅劑消除降解的游離熒光素，最后通過對熒光進行測定來擴增產物進行定量，這樣就可以避免了以往傳統的PCR后繁瑣的產物分析過程，然后可以在擴增反應中隨時終止反應，檢測即時PCR產物。

1 材料和方法

1.1 標本的采集和處理

對四川省阿壩州人民醫院流感暴發時就診的流感樣病例，體溫≥38℃，并伴有咳嗽，胸悶等流感樣癥狀的患者咽拭子標本3-5ml，并于24h冷藏送至四川省阿壩州疾病預防控制中心流感實驗室，加入2000u/ml青霉素、2000u/ml鏈霉素和100u/ml多粘菌素B，2-4℃保存備用。不能在24h接種MDCK細胞的存儲于-80℃。

1.2 核酸提取

檢測儀器為Roche品牌，LightCycler2.0卡盤式全自動熒光定量PCR儀，反應試劑盒由江蘇碩世有限公司提供。

1.3 病毒分離

采用MDCK細胞分離法來進行病毒分離，將已經成長為單層的MDCK細胞倒去生長液，用Hank’s液洗兩遍，加入1ml不含牛血清的維持液，至35℃孵育。第二天開始觀察細胞病變（CPU），當出現80%以上的CPU時凍存。采用微量半加敏血球凝集抑制試驗（HI），鑒定性別及亞型[3]。

1.4 熒光RT-PCR擴增

根據流感病毒A型、B型基因序列，利用引物設計軟件設計引物和探針，設計反應程序：第1步：37℃25min；94℃2min；第2步：94℃15s，55℃15s，72℃20s，5個循環；第3步：94℃5s，55℃35s，32個循環。在反應程序的第3步55℃末讀取熒光值。

2 結果

2.1 實時熒光定量RT-PCR

通過用實時熒光RT-PCR檢測，在613份標本中，實時熒光RT-PCR檢測陽性160份，陽性率為26.1%；經A、B型流感病毒實時熒光RT-PCR檢測，分別有140份和20份陽性，分別占87.5%和12.5%。

2.2 流感病毒的細胞培養與鑒定

實時熒光RT-PCR檢測陽性的160份標本，經過MDCK細胞培養、病毒分離鑒定，獲得82株流感病毒，陽性率為51.25%，占全部613份標本的13.4%。其中，A型流感病毒陽性68份，B型流感病毒陽性14份，陽性率分別占82.9%和17.1%。

2.3 兩種方法的檢測結果比較

通過實時熒光定量RT-PCR流感病毒檢出率與細胞培養比較差異有統計學意義，x2=26.5，P<0.005，表明兩者的陽性率差異有顯著意義。可見實時熒光RT-PCR檢測結果陽性率高于MDCK細胞培養陽性率。

3 討論

根據國家流行性感冒診斷標準及處理原則（GB15994-1995）的標準[4]，流行性感冒病原學的檢測方法有常規的病毒培養法（9-11D齡雞胚與MDCK細胞培養法）和快速診斷方法（間接免疫熒光法和間接免疫酶聯免疫法試驗）。這種經典的試驗方法雖然準確、可靠、穩定，但是對標本中的病毒含量要求比較高，必需要達到雞胚或MDCK培養法所需要的病毒含量[5]，而且對標本的采集、運輸、保存等要求比較高，試驗步驟繁瑣，確診需耗時10-15d。

從本研究結果來看，MDCK細胞分離法雖然是流感實驗室最常用、高敏感度、最準確的方法之一，但是該方法實驗周期長、操作復雜，在用于流感疫情暴發時的快速診斷會受到制約。所以實時熒光RT-PCR法的應用對提高流感檢測的靈敏度、快速準確地處置流感疫情有具有重大意義，在過去的重大流感暴發疫情中，都表明使用該方法靈敏度高、特異性強，所需要的時間短，目前已經在流感病毒的核酸檢測中得到應用同時，同時，該方法還采用完全閉管式操作，大大減少了擴增產物污染的機會。

參考文獻：

[1] 郭元吉，程小雯.流行感冒病毒及其實驗技術[M].北京：中國三峽出社.2007

[2] 張萍，韓文清.實時熒光RT-PCR與細胞培養法在流感病毒檢測中應用. 2011（01）：45-47

[3] Stone B，Burrows J，Schepetiuk S，et al. Rapid detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A viruses by realtime PCR[J]. J Virol Methods，2004，117 （2）：103- 112.

[4] 中華人們共和國國家標準GB15994-19951